188618. lajstromszámú szabadalom • Eljárás biológiailag aktív enkefalin-analógok előállítására
1 188 618 2 0 °C hőmérsékletre hűtjük és az oldatlan részeket kiszűrjük. A szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, az olajos maradékot feloldjuk etil-acetátban és az oldatot először 1 normál nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, ezután vízzel, majd 1,5 normál citromsavoldattal, és végül megint vízzel mossuk. Az etil-acetátos oldatot vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon szilárd anyag formájában 13,4 g (hozam: az elméletinek 104 %-a) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: delta (Boc), 1,3; delta [-N(CH3)2 ], 2,9. Tömegspektrum: molekulaion: 320. b) lépés l-Etil-amino-l-benzil-2-dimetil-amino-etán Egy gömblombikba bemérünk 30 ml vízmentes piridint, és hozzáadunk 1,1 g (30 millimól) nátrium-bórhidridet és 3,2 g (10 millimól), a fenti a) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet 40 órán át forralva keverjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük és az oldószert csökkentett nyomáson lcdesztilláljuk. Az olajos maradékhoz 1 óra alatt, lassan hozzáadunk 1,5 normál vizes citromsav-oldatot, és az oldat pH-ját 1 normál sósavval 5,0-ra állítjuk. Ezután a vizes elegyet etil-acetáttal egyszer kirázzuk, majd a vizes rész pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 9,5-re állítjuk. Ezután etil-acetáttal kirázzuk, az etil-acetátos részt vízmentes magnéziumszulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson lcdesztilláljuk. Ily módon olaj formájában 1,2 g (hozam: 58 %) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: delta (fenil), 7,2; delta [-N(CH3)]2,2,2. [a]p5 = + 28,78° (c = 0,5, metanol). c) lépés Nalfa-tereier-Butoxi-karbonil-D-alaniI-glicin-[N-etil-N-(l-benzil-2-dimeíil-amino)-etil]-anüd 15 ml dimetil-formamidhoz hozzáadunk 824 mg (4 millimól), a fenti b) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük és hozzáadunk 1,06 g (4 millimól) Nalfa-tercier-butoxi-karbonil- D-alanil-glicínt, 540 mg (4 millimól) 1-hidroxi-benzotriazolt és 824 mg (4 millimól) N,N'-dicíklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 4 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd további 72 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Utána 0 °C hőmérsékletre hűtjük, az oldatlan részeket kiszűrjük és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú clegyében és az elegy pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 9,5-re állítjuk. Az etil-acetátos részt elválasztjuk, vízzel egyszer mossuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékként kapott olajat felvisszük egy Water’s-féle szilikagél oszlopra, és az oszlopot egy System 500A jelzésű Water’s-féle preparatív folyadék-kromatográfban szakaszos gradiens eluációval (oldószer: acetonitril -*■ tetraliidro-furán) eluáljuk. Az egyes frakciókat vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel vizsgáljuk, a megfelelő frakciókat egyesítjük, és a terméket elkülönítjük. Ily módon 1,7 g (hozam: 100 %) cím szerinti vegyületet kapunk. [a]p = + 7,60° (c = 0,3, metanol). Analízis a C23H38N404 képlet alapján (mólsúly: 434,6): számított: C 63,57; H 8,81 ; N 12,89; talált: C 63,87; H 8,71; N 12,49. d) lépés Nalfa-tercier-Butoxi-karbonil-L-(N-metil)-tirozil-D-alanil-glicin-[N-etil-N-(l-benzil-2-dimetilamino)-etil]-amid 20 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyéhez hozzáadunk 1,7 g (3,9 millimól), a fenti c) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson, melegítés nélkül le desztilláljuk. A maradékként kapott olajat dietil-éterrel többször eldörzsöljük, az oldószert minden alkalommal leöntjük. A maradék olajat ezután feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében, az elegy pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 10,0-ra állítjuk. A szerves részt elválasztjuk, vízmentes magnézium-szulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, üy módon olajos terméket kapunk. 1,86 g (3,9 millimól) Nalfa-tercier-butoxi-karbonil-Nalfa-metil-L-tirozin-diciklohexil-amin-sót feloldunk 15 ml dimetil-formamidban, az oldatot —15 °C hőmérsékletre hűtjük és az erélyesen kevert oldathoz hozzáadunk 3 csepp N-metil-morfolint és 0,51 ml (3,9 millimól) klórhangyasav-izobutil-észtert. Az elegyet -15 °C hőmérsékleten keverjük, és közben az előző bekezdésben leírt módon előállított, helyettesített dipeptidet feloldjuk 5 ml dimetil-formamidban és az oldatot 0 °C hőmérsékletre hűtjük. Ezt a hűtött oldatot ezután hozzáadjuk a vegyes anhidrid hűtött, kevert oldatához, és a reakcióelegyet 4 órán át —15 °C hőmérsékleten keverjük. A szilárd részeket kiszűrjük és a szűrletről az oldószert csökkentett nyomáson le desztilláljuk. A maradékot feloldjuk etil-acetát és víz kétfázisú elegyében és az elegy pH-ját 2 normál nátrium-hidroxid-oldattal 9,8-ra állítjuk. Utána az etil-acetátos részt elválasztjuk, vízmentes magnéziumszulfáton megszárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. Ily módon olaj formájában 1,8 g (hozam: 76 %) cím szerinti vegyületet kapunk. NMR-spektrum: delta (Boc), 1,2; delta [-N(CH3)2 ], 2,2. e) lépés L-(N-Mctil)-tirozil-D-alanil-glicin-[N-etil-N-(l-benzil-2-dimetil-amino)-etil]amid-diacetát 25 ml trifluor-ecetsav és 3 ml anizol elegyében feloldunk 1,7 g. a fenti d) lépésben leírt módon kapott terméket. Az elegyet félórán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd fagyasztva szárítjuk. Az így kapott szilárd anyagot puffer-oldatban (13 % acetonitrilt tartalmazó, 0,1 mólos ammónium-acetát-oldat, pH = 4,1) 9,0 ml össztérfogatra oldjuk. Az oldatot felvisszük egy 4X 70 cm 5 10 15 20 25 30 35 40 46 5C 5b 60 65 6
