188475. lajstromszámú szabadalom • Eljárás benzotiopiranopiridinonok előállítására
1 188 475 2 38. példa 2-(Ciklohexil-metil)-8-metoxi-l,2,3,4-tetrahidro-10H-(l)-benzotiopirano[3,2-c]piridin-10-on-hidroklorid A 231ÖC olvadáspontú (bomlik) cím szerinti vegyület a 24. példa szerinti módszerrel analóg módon, de kiindulási anyagként 4-fluor-tiofenol helyett 4-metoxi-tiofenolt használva állítható elő. IR-spektrum (KBr pasztilla): 2920, 2840, 2300—2600 és 1690 cm’1. A szabad bázison CDCI3-ban felvett NMR-spektrum: 2,1 1H d (J = 2,5 Hz) h9 2,67 1H d (J = 9 Hz) h6 2,9 1H dd (J = 2,5 és 9 Hz) h7 6,14 3H s-OMe 6,48 2H széles s 2xH] 7,37 4H széles s 2x(H3+H4) 7,65 2H széles s (J = 6 Hz)-N-CH2-7,9-9,5 11 H m ciklohexil Elemzési eredmények a Cí0H36NC1SO2 képlet alapján: számított: C% = 63,22, H% = 6,90, N% = 3,69, Cl% = 9,33, S% = 8,44; talált: C% = 63,03, H% = 6,91, N% = 3,64, Cl% = 9,43, S% = 8,51. 39. példa Tablettákat állítunk elő a következő anyagokból: 20. példa szerinti vegyület mint hatóanyag 25 mg egy tablettához szükséges segédanyag 150 mg Segédanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnézium-sztearátot használunk. 40. példa Tablettákat állítunk elő a következő anyagokból: 16. példa szerinti vegyület mint hatóanyag 25 mg egy tablettához szükséges segédanyag 150 mg Segédanyagként laktózt, keményítőt, talkumot és magnézium-sztearátot használunk. A következőkben a találmány szerinti eljárással előállított vegyületek biokémiai vizsgálatát ismertetjük. A. teszt: Patkányok harántcsíkolt dopamin-receptor kötő helyeinél (3 H)-spiroperidollal történő helyettesítés aj Radioligandum Ilyen komponenseként 1 juCi/1 pl aktivitású, etanollal készült /fenil-4(n)-3H/-spiroperidol (az Amersham International cég TRK 570 jelzés alatt szállítja, 21 Ci/míllimól aktivitású) oldatot használunk. Ezt az oldatot 250 juCi/1 ml etanol aktivitásúra hígítjuk törzsoldat előállítása céljából. Ezt a törzsoldatot azután 3,2/10000 arányban hígítjuk a következőkben megadott összetételű elemzési pufferrel és az így kapott hígításból 0,1 ml térfogatú adagokat használunk 2 ml-es elemzési térfogatokhoz. Ez annyit jelent, hogy egy-egy elemzésnél 0,19 nanomól (3 H)-spiroperidolt — amelynek aktivitása 0,08 juCi — használunk. b) Elemzési puffer Az elemzési puffer olyan módosított, 7,6-es pH-jú, 50 millimólos TRISZ-HC1 puffer, amely a következő adalékanyagokat tartalmazza : nátrium-klorid 120millimól kálium-klorid 5 millimól magnézium-klorid 1 millimól kalcium-klorid 2 millimól pargilin 10 mikrontól I-aszkorbinsav 0,1% ej Membrán-készítmény A harántcsíkolt izomzatút eltávolítjuk hím CFHB-törzsbeli patkányokból és 20-szoros térfogatú jéghideg 0,32 mólos szacharóz-oldatban homogenizáljuk teflonnal bevont üveghomogenizátorral. A homogenizátumot 1000 g-vel centrifugáljuk 10 percen át, majd a felülúszót 30000 g-vel 30 percen át újracentrifugáljuk. A felülúszót ezután elhajítjuk, míg a kapott szemcsés anyagot újraszuszpendáljuk 30-szoros térfogatú jéghideg elemzési pufferben történő homogenizálással. dj Nem specifikus kötés Nem specifikus kötést hozunk létre úgy, hogy elemzési vakmintákhoz 1 jumól (+)-butaklamolt adagolunk. Ehhez 20 mikromólos desztillált vizes törzsoldatot használunk. ej Helyettesítő ( vizsgált) vegyületek Desztillált vízzel olyan oldatokat készítünk a vizsgált vegyületekből, amelyek koncentrációja húszszorosa az elemzési végső koncentrációnak. fj Teszt leírása 1,3 ml elemzési puffer 0,5 ml membrán készítmény (szuszpenzió) 0,1 ml desztillált víz vagy hatóanyag-oldat 0,1 ml /3H/-spiroperidol-higítás A tesztelegyet jeges fürdőben állítjuk össze, legutoljára a /3 H/-spiroperidol-higítást adagolva. Az elegyet 37 cC-on 10 percen át inkubáljuk, majd a kötött liganduriot Whatman GF/C jelzésű üvegszálas szűrőn át vákuum alatt végzett szűréssel különítjük el, és ezután a szűrőt 10—10 ml jéghideg elemzési pufferrel kétszer átöblítjük. A szűrőket ezután 80°C-on szárítjuk, majd 5 ml térfogatban alkalmazott ECONOFLUOR (NEN) szcintillációs folyadékban vetjük alá sugárzásszámlálásnak. Mindegyik tesztet, kontrollt, vakmintát és az alkalmazott négyféle helyettesítő koncentráció mindegyikét háromszoros ismétlésben vizsgáljuk. Az A tesztre az IC50 értékeket grafikusan — a dózis logaritmusa, mint egyik paraméter függvényében, a specifikus kötési helyek százalékos gátlását, mint másik paramétert ábrázolva — kapott görbéből állapítjuk meg. B. teszt: Patkányok kortikoidális alfa] receptor kötő helyeinél /3 H/-prazosinnal történő helyettesítés a) Radioligandum Ilyen komponensként 1 pCill pl aktivitású oldat formájában /3 H/-prazosint (az Amersham International cég TRK 647 jelzés alatt szállítja, 28 Ci/millimól aktivitású) használunk. Ezt a törzsoldatot 1/18000 arányban hígítjuk az elemzési pufferrel és a higításból 0,1 ml térfogatú adagokat használunk 2 ml-es elemzési térfogatokhoz. Ez annyit jelent, hogy egy-egy elemzésnél 0,1 nanomól /? H/-prazosint — amelynek aktivitása 0,0056 pCi elemzésenként — használunk. b) Membrán készítmény Hím CFHB-törzsbeli patkányoknak eltávolítjuk az agykérgét, majd 20-szoros térfogatú jéghideg 0,32 mólos szacharóz-oldatban homogenizáljuk teflonnal bevont üveghomogenizátorral. A homogenizátumot 1000 g-vel centrifugáljuk 10 percen át, majd a képződött szemcsés részt eldobjuk és a felülúszót 30000 g-vel 30 percen át újracentrifugáljuk. A felülúszót ezután elhajítjuk, míg a kapott szemcsés anyagot újraszuszpendáljuk 50-szeres térfogatú 50 millimólos TRISZ-HC1 pufferben (pH-ja 7,5), azaz az elemzési pufferben. ej Nem specifikus kötés Nem specifikus kötést hozunk létre úgy, hogy elemzési vakmintákhoz lOOjamól 1-noradrenalint adagolunk. Ehhez naponta frissen 0,1%-os vizes aszkorbinsav-oldat-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
