188298. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humánproteineket tartalmazó véralvadás-fokozó gyógyászati készítmény előállításáar
1 188 298 2 Prekallikrein-készítmény: A készítmény előállítása Harpel szerint történik, a módszert M. S. Horowith (New York Blood Center) módosította. A humán citrátplazmát DEAE-cellulózzal kezeljük. A DEAE-cellulózra nem kötődő frakció tartalmazza a prekallikreint. Pozitív kontroll (standard): Standardként (azaz viszonyítási értékként) a Bureau of Biologies (BoB) Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20205, Amerikai Egyesült Államok, albuminkészítményét használjuk. Ez a készítmény prekallikrein-aktivátort tartalmaz. A BoB-standarddal jelzett kallikrein készítmény az 1 viszonyítási értéknek felel meg és 100%-kal egyenértékű. Minta: A mintát az eredeti térfogatban feloldjuk és hígítatlanul használjuk a teszthez. 3. Teszt: 37 °C-os vízfürdőn műanyag kémcsőbe pipettázunk 0,05 ml prekallikrein készítményt, 0,05 ml a) BoB-standardot viszonyítási értéknek b) a második menetben a teszt-mintát. 10 perces inkubálás után 37 °C-on 0,7 ml pufferoldatot és 0,1 ml kromogén S-2302 anyagot pipettázunk fel. Az elegyet egy 37 °C-ra előmelegített fotométerbe helyezzük és mérjük a percenként tapasztalt optikai sűrűség-növekedést 405 nm hullámhossznál és 10 mm rétegvastagságnál. A AOD/ min növekedést, azaz a minta aktivitását az 1 értékű BoB-standardhoz képest számokban, illetve százalékosan fejezzük ki. A találmány szerinti készítmény affinitáskromatográfiás elválasztását dextránszulfát-Sepharose-n az 1. ábra mutatja. A IX faktort tartalmazó és FEIB-aktivitással rendelkező proteinek elektroforetikus elválasztását a 2. ábra mutatja. A kísérletet a következőképpen végezhetjük. A különböző proteinek elektroforetikus elválasztásánál hordozóként szolgál a cellulózacetátmembrán, amely pH = 8,6 értékű, 0,075 ionerösségű elektroforézis-pufferrel van átnedvesítve. Erre a membránra az analizálandó mintákat a standardként használt normális humánplazmával együtt felvisszük és az elektromos mezőben elválasztjuk. Az elválasztás úgy történik, hogy a különböző töltésű proteinek az elektromos térben különböző gyorsan vándorolnak. Erre a célra a mintákkal ellátott membránt speciális elektroforézis-pufferrel töltött cellában 16-18 percig 250 Volt feszültségnél, 4-6 milliamper kezdeti áramerősségnél kezeljük. Az elválasztási folyamat befejezése után a különböző proteineket úgy tesszük láthatóvá, hogy a membránt egy fixáló, illetve színező oldatba helyezzük. Néhány öblítőfürdö után a membránt egy további fürdőben átlátszóvá tesszük, egy üveglemezre felvisszük és 100 °C-nál egy szárítószekrényben szárítjuk. A szárított membránt egy automatikusan regisztráló és integráló denzitométerben analizáljuk és így kapjuk a 2. ábrán látható elválasztási görbéket A különböző proteinek eltérő erősségű sávoknál jelentkeznek, amelyekhez tartozó területek a megfelelő proteinek viszonylagos százalékos értékeivel arányosak. Ezeket a területeket a denzitométer automatikus integrálásával határozhatjuk meg. A minta különböző sávjait, illetve proteinjeit úgy feleltetjük meg a definiált proteineknek, illetve protein-csoportoknak, hogy összehasolítjuk a standardként használt humánplazma sávjaival. Utóbbit az elektroforetikus analízis során 5 proteincsoportba osztjuk fel, melyeket az elektromos térben mutatott csökkenő vándorlási sebesség sorrendjében az alábbiakban jelölünk meg: albumin, a-g!obulin, ß-globulin, fibrinogén és y-globulin. A FEIBA-egység definíciója, valamint meghatározása (hatékonysági teszt) az irodalomban szerepel, méghozzá a 350 726 számú osztrák szabadalmi leírásban, amely megfelel a 4 160 025 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak és a 2 734 821 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratnak. A II, VII, IX és X alvadási faktorok hatásának meghatározása is fent említett irodalomban szerepel. A Vili-faktor inhibitor plazmában inkubálás után a FEIBA maradék aktivitását az alábbi módon határoztuk meg. /. Reagensek: A felhasználandó reagenseket a FEIBA-egységek meghatározásával kapcsolatban írták le a 350 726 sz. osztrák szabadalmi leírásban, amely megfelel a 4 160 025 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásnak és a 2 734 821 sz. német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratnak. 2. Teszt: Egy 50 FEIBA-egység/ml-re beállított készítményből 7 g/liter nátrium-klorid és 7 g/1 nátriumcitrát ■ 2H20 elegyének oldatával, mint hígítószerrel az alábbi hígításokat állítottuk elő: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 és 1:64. Ebből a hat hígításból mindig l:10-es hígításban állítottunk elő VIII faktor-inhibitor plazmát (0,05 ml előhígított minta + 0,45 ml VIII faktor-inhibitor plazma). A VIII faktor-inhibitor plazmában ezeket az 1:10 hígításokat („inkubációs elegyeket”) azonnal és egy órás 37 °C-on végzett inkubálás után analizáljuk az. alábbi tesztmódszer szerint: 0,1 ml „inkubációs elegy” 0,1 ml foszfolipid-kaolin-szuszpenzió 1 percig 37 °C-on inkubáljuk 0,1 ml m/40 kalcium-klorid. A kalcium-klorid hozzáadásától az alvadék képződéséig eltelt időt stopperórával mérjük a hatékonysági tesztben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
