188211. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens glikozilált hemoglobin meghatározására
1 188 211 2 ami a félig maximális fluoreszcencia-kioltásig eltelt. A mért értekeket a Táblázat tartalmazza. A Táblázat adataiból kitűnik, hogy az adalékanyagok egyedül hemoglobinra - a kísérleti ingadozásoktól eltekintve - kevés befolyást gyakorolnak, ezzel szemben az inozit-hexafoszfát hatását szignifikánsan növelik. Ez a hatás az inozit-hexafoszfát hemoglobinon való kötésének stabilizálására vezethető vissza. 7. példa: A következő reagenseket készítjük el: la jelű reagens: 200 mmólos bisz-trisz-puffer, pH 6,0(6,5)7,0 szaponin 0,1 g/liter 0,1 g/liter digitonin Ib jelű reagens: mint az la jelű, de 0,08 mmól/ liter koncentrációban járulékosan még inozit-hexafoszfátot is oldunk benne II jelű reagens: 7 mmólos bisz-trisz-puffer, pH 6,0(6,5)7,0 2 mmól/liter 2,2'-azino-di-[3-etil-benztiazolin-szulfonát(ó)] 20 mg/liter haptoglobin 0,2 g/ml szacharóz III jelű reagens: 0,5 mólos citrát-puffer, Ph 3,8 30 mmól/liter nátrium-perborát, 3 g/liter szaponin. Egészséges egyéntől származó, mosott eritrocitákat az la jelű reagenssel 0,5 mg/ml hemoglobinkoncentrációra hígítunk, ennek során az eritrociták detergensek hatására gyorsan hemolízist szenvednek. A hemolizátumot szilárd nátrium-ditionittal 50 mg/ml koncentrációig és szilárd nátrium-nitrittel 5 mg/ml koncentrációig elegyítjük. Szobahőmérsékleten való rövid inkubálás után az előkezelt hemolizátum egy-egy alikvot részét az la és az Ib jelű reagenssel 0,5 mg/liter hemoglobin-koncentrációra állítjuk be és hígított oldatokat Abbot VP automata elemzökészülék mintaedényeibe töltjük. A készülék az oldat 2,5 pliterét összekeveri a II jelű reagens 250 páterével, 40 másodpercig inkubál 25 °C-on, és indítja a peroxidáz-reakciót 150 pliter III jelű reagens hozzáadásával. A peroxidáz-reakciót 2 percen keresztül követjük az extinkció növekedésének mérésével, a 415/450 nm-es szűrőkombináció alkalmazásával és a reakciósebességet AE/2 minben fejezzük ki. Az Ib jelű reagensek a mintához való hozzáadásánál kapott reakciósebességet az la jelű reagenssel mérttel elosztjuk. Az alábbi Táblázat mérési adataiból kitűnik, hogy az allosztérikus effektor a teljes pH-tartományban hatásos. I- • ih niI-Ari'L á E:.2 min hi-val Alt/2 min Ib-vel A kél mérési érték a es p e e va|^ dőkezelés után való előkezelés után hányudma 6.0 0,910 0,171 0,188 6,5 0,972 0,179 0,184 7.0 0.875 0.192 0,220 Ismert mennyiségű glikozilált hemoglobint tartalmazó standard-minták analóg mérésével és kiértékelésével kalibrációs görbét készítünk, amelyből az ismeretlen minták HbA[-értéke megállapítható. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás glikozilált hemoglobin meghatározására vérmintákban, amelynek során először a vérminta kémiai vagy fizikai kezelésével az eritrocitákból szabaddá tesszük a glikozilált és nem glikozilált hemoglobint, adót esetben a hemoglobint methemoglobinná alakítjuk át, utána a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását hajtjuk végre, és végül meghatározzuk a hemoglobin glikozilált részét, azzal jellemezve, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását haptoglobinon való kötéssel végezzük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálását valamilyen alkalmas pufferrendszer és/vagy konformációváltozást okozó anyagként 2,3-difoszfo-glicerinsav, inozit-hexafoszfát, inozithexaszulfát vagy mellitsav, illetve hem-kötö ligandumokként alkil-izocianid, oxigén, szén-monoxid, nitrogén-monoxid, fluorid, azid, cianid vagy víz jelenlétében végezzük. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a haptoglobint a hemoglobinhoz képest 2-50-szeres feleslegben alkalmazzuk. 4. Reagens glikozilált hemoglobin meghatározására vérmintákban, az eritrociták szokásos hemolízise után, azzal jellemezve, hogy 50-200 mmól/liter, 6,0-7,0 pH-értékü pufferrendszert, 20-160 mg/liter szabad vagy hordozóhoz kötött haptoglobint, valamint adott esetben 0,05-0,2 mmól/liter egy vagy több, az allosztérikus effektorhelyre kötési befolyással bíró, konformáció-változást okozó anyagot, 0,5-100 mmól/liter egy vagy több hem-kötő ligandumot és/vagy 0,25-1000 mmól/liter ionos kötésekre stabilizáló hatású polihidroxi-vegyületet tartalmaz. 5. Reagens glikozilált és nem glikozilált hemoglobin differenciálására, azzal jellemezve, hogy 20-160 mg/liter haptoglobint tartalmaz szabad vagy hordozóhoz kötött formában. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3 oldal rajz
