188077. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új antibiotikus hatású BMG162-AF2 előállítására
1 188 077 2 közben 27 °C-on aerob körülmények között tenyésztést végzünk. A BMG162-aF2 kimutatását kísérleti mikroorganizmusként a Bacillus subtilis PCI-219 törzset használva azzal a szabványosított csészés-lemezes módszerrel végezhetjük, amelyet szokásos módon használtak ismert antibiotikumok kimutatására. A Bacillus genuszhoz tartozó, BMG162-aF2 antibiotikumot termelni képes törzs korábban említett rázatásos tenyésztésen túlmenően ipari méretekben tenyészthető üvegedényes-fermentoros vagy tartályos tenyésztéssel is, mely utóbbi módszereket a levegőztetéses-keveréses tenyésztésekhez hasznosítanak. Ipari méretekben történő előállításnál tehát a korábban említett összetételű folyékony táptalajt 20-40 órán át rázatás közben tenyésztjük, és beoltását az oltótenyészetböl 0,5-2,0 térfogat%-os mennyiségekkel hajtjuk végre. A tenyésztést követően a tenyészetet szűrjük, majd a szűrletből a BMG162-aF2 antibiotikumot elkülönítjük oszlopkromatografálással, oszloptöltetként aktív csoportként karboxilcsoportot tartalmazó, gyenge kationos ioncserélő gyantát hasznosítva. Gyenge kationos ioncserélő gyantára példaképpen említhetjük a Rohm and Haas Co. amerikai cég által Amberlite IRC-50 és CG-50 márkanév alatt forgalmazott ioncserélő gyantákat (aktív csoportként kizárólag karboxilcsoportokat tartalmaznak), a Bayer NSZK-beli cég által Lewatit CNP márkanév alatt forgalomba hozott ioncserélő gyantát (aktív csoportokként karboxilcsoportokat és szulfonsavcsoportokat tartalmaz) vagy a Pharmacia Fine Chemicals svéd cég által CM-Sephadex márkanév alatt forgalmazott ioncserélő gyantát (karboxi-metil-dextrán). Ezek a gyanták felhasználhatók hidrogén-, nátrium- vagy ammóniumformában vagy pedig ezek alkotta vegyes formában. A gyantán adszorbeálódott BMG162-aF2 antibiotikumot egy sav, például sósav vagy ecetsav vizes oldatával vagy pedig egy só, például nátriumklorid vizes oldatával eluálhatjuk. A termék antibiotikum további tisztítása céljából extrahálási, szeparálási és tisztítási módszerekként például gélszürési vagy az említett gyantákat hasznosító ultraszűrési módszereket vagy ezek megfelelő kombinációit hasznosíthatjuk. Tekintettel arra, hogy szabad bázis formájában nem stabil, a BMG162-aF2 antibiotikumot hidrokloridsója alakjában nyerjük ki. A só higroszkópos és hidrátot képez. A BMGl62-aF2-hidrokloridhidrát fizikai-kémiai jellemzői a következők; 1. Extrém higroszkóposságára tekintettel olvadáspontját lehetetlen megmérni. 2. Fajlagos forgatóképessége [a]j>4= — 11° (c= 1,0%, víz). 3. Elemzési eredmények a C17H37N704 • 3 HC1 • 2 H20 képlet alapján: számított: C% = 37,20, H% = 8,08, N% = 17,86, Cl%= 19,38; talált: C% = 37,55, H% = 7,89, N% = 17,52, Cl%= 18,61. 4. Az ’H-NMR-spektrum az 1. ábrán látható. 5. A 13C-NMR-spektrum a 2. ábrán látható. 6. A 15N-NMR-spektrum a 3. ábrán látható. A spektrumban hét nitrogénatom figyelhető meg (a guanidilcsoport három nitrogénatomja kétcsúcsú jelként jelentkezik). A BMG162-aF2-hidroklorid jól oldódik vízben és metanolban, azonban rosszul oldódik vagy oldhatatlan etanolban, etil-acetátban, kloroformban és benzolban. Pozitív ninhidrin-, Sakaguchi- és Rydon-Smith-reakciót ad. Hordozóanyagként Avicel márkanevűt (mikrokristályos cellulóz) és futtatószerként butanol, etanol és víz 4 : 1 : 2 térfogatarányú elegyét használva vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatban a BMG162-aF2 hidroklorid egyetlen foltot ad Rf=0,14 és Rf = 0,20 értékekkel. Hangyasav, ecetsav és víz 1 : 3 : 36 térfogatarányú elegyével végrehajtott nagyfeszültségű papírelektroforézises vizsgálatban (3500 V, 15 perc) a BMG162-aF2 viszonylagos, 1,70—1,74 értékű mozgékonyságot mutat, az alaninét 1,0-nak véve. A következőkben a BMG162-aF2 biológiai tulajdonságait ismertetjük. Miként a későbbiekből kitűnik, a BMG162-aF2-hidroklorid csak gyenge gátló aktivitást mutat Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben, ugyanakkor a gyógyításban és a túlélési időszak meghosszabbításában jelentős hatást fejt ki egereknél a leukémia L1210, EL-4, Ehrlich aszcitesz-tumor és a Sarcoma 180 megbetegedések esetén. Nyilvánvaló tehát, hogy ez az antibiotikum elsősorban mint rákos megbetegedések elleni ágens hasznosítható. (1) A BMG162-aF2 antibakteriális aktivitása A BMG162-aF2 antibiotikumnak gyenge az antibakteriális aktivitása. Agar-agaron különböző baktériumokkal szembeni minimális gátlási koncentrációit a 2-1-2-3. táblázatokban adjuk meg. A táblázatokban megadott eredményeket olyan kísérletekben kaptuk, amelyeket BMG162-aF2- hidrokloriddal az agar-agar hígításos módszer szerint végeztük el. Látható a 2-1. táblázatból, hogy a BMG162-aF2 gyengén gátolja a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok fejlődését. 2-1. táblázat Antibakteriális aktivitás Minimális Kísérleti mikroorganizmus gátlási koncentráció (ucg/ml) 1. Staphylococcus aureus FDA209P 100 2. Staphylococcus aureus Smith 12,5 3. Micrococcus flavus FDA 16 25 4. Micrococcus lysodeikticus IF03333 100 5. Sarcina lutea PCI 1001 100 6. Bacillus anthracis 25 7. Bacillus subtilis NRRL B-558 100 8. Bacillus subtilis PCI219 6,25 9. Bacillus cereus ATCC10702 100 10. Corynebacterium bovis 1810 11. Escherichia coli NIHJ 50 100 12. Escherichia coli K-12 100 13. Escherichia coli ML 1629 100 14. Shigella dysenteriae JS 11910 100 15. Shigella flexneri 4bJS 11811 100 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
