188073. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 2,5-diketo-D-glükonsav előállítására
1 188 073 2 A találmány tárgya új mikrobiológiai eljárás 2,5- diketo-D-glukonsavnak (a következőkben 2,5- DKG-nak nevezzük) D-glükózból való előállítására. Részletesebben a találmány a 2,5-DKG előállításának olyan módszerére vonatkozik, amelyet az 5 Erwinia fajba tartozó új mikroorganizmusok fermentálásával vagy a D-glükóznak az említett mikroorganizmusokkal vagy ezek kezelt termékeivel, például nyugalomban levő sejtjeikkel, rögzített sejtjeikkel, őrölt sejtjeikkel, vagy a belőlük extrahált 10 enzimekkel való egyszerű érintkeztetéssel hajtunk végre, és ezek a sejtek folyékony közegben szuszpendálva vagy stacionárius ágy felületén rögzítve lehetnek. A 2,5-diketo-D-glukonsav az L-aszkorbinsav 15 gyártásában hasznos közbenső termék. Ugyanis a 2,5-DKG szelektíven és sztereospecifikusan 2-keto- L-glukonsavvá, az L-aszkorbinsav elővegyületévé redukálható, és ez az L-aszkorbinsav előállítására sokat ígérő új módszernek bizonyul (lásd a 20 3 922 194, 3 959 076, 3 963 574 és 3 998 697 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Mindezekben az ismert eljáráokban a 2,5-diketo- D-glukonsav előállítását kizárólag az Acetobacter, 25 Acetomonas, Gluconobacter és Pseudomonas nemekbe tartozó aerob mikroorganizmus törzsek tenyésztésével érték el. Mindezideig egyetlen esetet sem közöltek arra vonatkozóan, hogy a vegyület előállítását az Erwinia nembe tartozó fakultatív 30 anaerob törzsek tenyésztésével érték volna el. Ezért a találmány elsődleges tárgya eljárás a 2,5- diketo-D-glukonsavnak az Erwinia nembe tartozó, újólag izolált mikroorganizmusok használatával való előállítására. 35 A találmány további tárgya eljárás a 2,5-diketo- D-glukonsavnak nagy kitermeléssel, folyékony táptalajban nagy koncentrációban való előállítására, hogy az előbb említett sokat ígérő új módszer gazdasági hasznosítását megkönnyítsük. 40 A 2,5-diketo-D-glukonsav előállítására szolgáló találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy az Erwinia nem 2,5-diketo-D-glukonsavat termelő mikroorganizmusát vagy ebből előállított bármely terméket (az említett mikroorganizmus sejtjeinek ke- 45 zelésével kapott bármely terméket) D-glükózzal érintkeztetünk. A találmány szerinti eljárás sokféle módon valósítható meg; például az említett mikroorganizmusnak legalább egy törzsét D-glükózt tartalmazó vi- 50 zes táptalajban tenyésztjük, vagy egyszerűen az említett mikroorganizmusokat vagy ezek kezelt termékeit, például nyugalomban levő sejtjeit, rögzített sejtjeit, belőlük extrahált sejtmentes enzimeket D-glükóztartalmú hordozóalappal érintkeztetjük. 55 Aza egész leírásban és az igénypontokban mindenütt használt „tenyésztés” kifejezés minden olyan mikrobiológiai műveletet magában foglal, amelyben a mikroorganizmusokat a táptalajba azért oltjuk be és inkubáljuk, hogy ebben fermentá- go ló hatást idézzünk elő. Az „érinticeztetés” kifejezés esetünkben azt jelenti, hogy a mikroorganizmusokat vagy ezek bármely kezelt termékét a hordozóalappal úgy egyesítjük, hogy tekintet nélkül az érintkeztetés, azaz az inkubálás időtartamára, a g5 D-glükóznak 2,5-diketo-D-glukonsavvá való alakulását elérjük. A találmány szerinti eljárásban az Erwinia nembe tartozó bármely mikroorganizmust használhatjuk, amennyiben ezek a mikroorganizmusok a D-glükózt szelektíve oxidálni és 2,5-diketo-D- glukonsavvá alakítani képesek. Az izolált és a feltalálók által az Erwinia nem új fajába tartozóként meghatározott ilyen törzsek példáit az alábbi 1. táblázatban foglaltuk össze. Mindezeket a törzseket Japánban a Fermentation Research Instituteban és Washington D. C.-ben az American Type Culture Collection-ban FERM-P, illetve ATCC számokkal megjelölve letétbe helyeztük; ezeket három új fajba tartozónak találtuk, és mindegyik faj a fajon belül a többihez képest új változatot alkot. 1. táblázat SHS-jel Az izolált mikroorganizmusok elnevezése FERM-P ATCC 2003 Erwinia citreus 5449 31 623 2006 Erwinia punctata 5452 31 626 2004 Erwinia punctata var. 5450 31 624 2005 Erwinia punctata var. 5451 31 625 2007 Erwinia punctata var. 5453 31 627 2008 Erwinia terreus 5454 31 628 2009 Erwinia terreus var. 5455 31 629 2010 Erwinia terreus var. 5456 31 630 2011 Erwinia terreus var. 5457 31 631 Ezen mikroorganizmusok rendszertani tanulmányozásának részleteit együttesen az alábbi 2. táblázatban írjuk le. 2. táblázat A. Megfigyelések 1. A sejtek alakja (Húslé-agar ferde lemezen 28 °C-on, 24,72 és 168 óra hosszat inkubálva.) Mindegyik megfigyelt törzs közös tulajdonsága az, hogy főleg egyedülálló, a felsorolt méretű, lekerekített végű pálcika alakú sejtekből áll. Egyes törzseknél néha a feltüntetett méretű deformált sejtek jelenlétét figyeltük meg. Sejtek túlnyomó többsége: Törzs SHS Méretek (p) Megnyúlt sejtek Deformált sejtek: Kiszélesedett sejtek Méretek (p) 2003 0,8-1,2 x 1,0-2,9megfigyelt megfigyelt 1,6 * 6,0-7,0 2004' 1,0-1,5 x 1,5-3,3megfigyelt megfigyelt 0,7-0,8 x 4,0-5,0 2005 1,0-1,3 x 1,6-2,1 megfigyelt megfigyelt 0,7-0,8 x 2,4-3,0 2006 1,1-1,3 x l,3-l,9megfigyeltmegfigyelt 0,6-0,8 x 2,4-2,7 2007 1,0-1,2 x 1,7-2,3 nincs nincs-2008 0,8-0,9 x 1,5-1,7 nincs nincs-2009 1,0 x 1,2-2,1 nincs nincs-2010 1,0 x 1,0-2,0 nincs nincs-2011 1,1 x 1,3-2,0 nincs nincs-2. Ostorosság és mozgékonyság (Húslé-agar ferde lemezen 20 és 25 °C-on, 18-24 óra hosszat inkubálva). A mozgékonyságot függő-csepp módszerrel határoztuk meg. Az ostorosságot Toda módszerével való megfes-2
