187835. lajstromszámú szabadalom • Eljárás (amido)-N-helyettesített bleomicinek és savaddiciós sóik előállítására
1 187 835 2 tartalmú (amido)-N-helyettesített bleomicin B2 vegyületeket. Hasonlóképpen, a 2. táblázatban 1., 6., 21-38., 64. és 65. sorszám alatt feltüntetett vegyületeket dezamido-bleomicin A/-C, 3-(/S/-l'-fenil-etil)amino-propil-amino-dezamido-bleomicin és 3-(3- n-butil-amino-propil-amino)-propil-amino-dezamido-bleomicin (mindhárom vegyület réztartalmú) és a kívánt terméknek megfelelő amin reagáltatásával állítjuk elő. C lépés 880 mg, a B lépésben előállított vegyületet 20 ml desztillált vízben oldunk, majd sómentesítés céljából 100 ml térfogatú, desztillált vizes Amberlite® XAD-2 gyantával töltött oszlopra visszük. A réztartalmú vegyület az oszlopon adszorbeálódik. Ezután a gyantát egymást követően 300 ml, 5% EDTA.2Na-ot tartalmazó vizes nátrium-klorid-oldat-. tál, 100 ml 2%-os vizes nátrium-klorid-oldattal és 250 ml desztillált vízzel mossuk. Ezután a réztartalmú vegyületet 1/50 n hidrogén-klorid, metanol 1 : 4 térfogatarányú elegyével eluáljuk, a 290 mp körül abszorpciós maximumot adó frakciókat egyesítjük. Az egyesített frakciók pH-ját 6,0-ra állítjuk hidroxil-ciklusú Dowex 44 gyantával (Dow Chemical Co.), majd az oldatot csökkentett nyomáson bepároljuk és liofilizáljuk. 93%-os hozammal 790 mg rézmentes (amido)-N-[3-(/S/-l'-fenil-etil-amino)propilj-bleomicin B2 hidrogén-kloridot nyerünk fehér, amorf por formájában. UV abszorpciós maxi- „ műm és [E 1%/1 cm : 291mp (79)]. Infravörös abszorpciós maximumok káliumbromid tablettában: 3425, 2950, 1720, 1640, 1555, 1450, 1400, 1360, 1320, 1260, 1190, 1060, 880,910, 805, 770 és 700 cm-1. A többi fizikokémiai jellemzőt a 2. táblázatban ismertetjük. A kívánt termék eluálását hidrogén-klorid, metanol elegy helyett kénsav, metanol; ecetsav, metanol vagy citromsav, metanol eleggyel, végezzük, így a megfelelő kénsavas, ecetsavas vagy citromsavas sót nyerjük. Valamennyi só IR abszorpciós maximuma hasonló a hidrogén-klorid-sóra megadotthoz, azzal a kivétellel, hogy a kénsavas só a hidrogén-klorid sónál megadott abszorpciós maximumokon kívül 1120 cm '-nél is abszorpciós maximumot ad. 2. példa A lépés Fusarim roseum IFÖ 7189 (deponálási helye: Institute for Fermentation, Osaka) tenyésztésével nyert 400 g gomha-micéliumot 4 ml pH 7,5-ös 1/20 mol/1 foszfátpufferrel homogenizálunk. A homogén elegyhez 10 g réztartalmú (amido)-N-[3-(/S/-T- fenil-etil-amino)-propil]-bleomicin B2 1 liter fenti foszfátpufferben készült oldatát adjuk. Az elegyet 37 °C hőmérsékleten 20 órán át reagáltatjuk. Ezután a reakcióelegyet szűrősegédanyaggal elkeverjük és vákuum-szivatással leszűrjük. A csapadékot az előzőekben alkalmazott pufferrel mossuk. A szűrletet és a mosófolyadékot egyesítjük, 1 liter térfogatú, desztillált vizes Amberlite® XAD-2 adszorpciós gyantával töltött oszlopon engedjük át, melyen a kívánt termék adszorbeálódik. A sókat 21 desztillált vízzel kimossuk az oszlopból, majd az adszorbeált fázist 50%-os vizes metanollal eluáljuk, 5 1 kék vagy kékeszöld frakciót nyerünk. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk, majd 350 ml 80%-os metanolban oldjuk és 79 ml, 80%-os metanolos alumíniumoxiddal töltött oszlopra visszük. Az oszlopot 100 ml 80%-os metanollal mossuk, majd 40%-os metanollal fejlesztjük ki, az összegyűjtött kék színű eluátumfrakciók térfogata 350 ml. Az egyesített frakciókat csökkentett nyomáson bepároljuk, majd desztillált vízben oldjuk, 600 ml térfogatú nátrium ciklusú CM Sephadex® C-25 gyantával (Pharmacia Fine Chemicals Co.) töltött, pH 4,5-ös, 1/20 mól/l-es ecetsav, nátrium-acetátpufferrel ekvilibrált oszlopra visszük, a kívánt termék az oszlopon adszorbeálódik. Az adszorbeált fázist lineáris koncentráció gradiens eljárással eluáljuk, a koncentrációgradienst úgy hozzuk létre, hogy az előzőekben leírt pufferben az 1.0 mol/1 koncentráció eléréséig folyamatosan növeljük a nátrium mennyiségét. A 0,2 mol/1 nátriumkoncentráció körüli értéknél eluált kék színű frakciókat ezután Diaion® HP 40 alkalmazásával sómentesítjük, majd liofilizáljuk. 79%-os hozammal 7.1 g rézmentes (amido)-N-[3-(/S/-l'-fenil-etilamino)-propil]-bleomicinsavat nyerünk kék színű amorf por formájában. Ennek UV abszorpciós maximuma (E 1%/1 cm) desztillált vízben mérve 245 mp (121) és 293 mp (119). Infravörös abszorpciós maximumok kálium-bromid tablettában mérve: 3450, 2975, 2940, 1720, 1645, 1580, 1555, 1460, 1370, 1300, 1190, 1140, 1095, 1060, 1005, 980, 880, 765 és 700. A többi fizikokémiai jellemzőt a 7. táblázatban ismertetjük. Az előbbiekben leírthoz hasonlóan állítunk elő (amido)-N-n-oktil-bleomîcinsavat (amido)-N-noktil-bleomicin B2-ből és (amido)-N-(3-dibutilamino-propil)-bleomicinsavat (amido)-N-(3-dibutil-amino-propil)-bleomicin B2-ből. Ezeknek a savaknak a fizikokémiai jellemzőit a 7. táblázatban ismertetjük. 1,0 g, az A lépés szerinti eljárással előállított réztartalmú (amido)-N-[3-(/S/-l'-fenil-etil-amino)propil]-bleomicinsavat és 1,71 g HOBT-t 10 ml DMF-ban oldunk. Az 1. példa B lépésében ismertetett eljáráshoz hasonlóan járunk el, 1,31 g DCC-t használunk. A fenti oldatot 340 mg 3-[N-(3'-ciklooktil-metil-amino)-propil-N-metil-amino]-propílaminnal 3 órán át reagáltatva kondenzációs terméket nyerünk. Az 1. példában megadotthoz hasonlóan a reakcióelegyet acetonnal kezeljük, majd CMSephadex® kromatográfiás eljárással tisztítjuk és 100 ml térfogatú, Amberlite® XAD-2-veJ töltött oszlopra visszük, melyen az anyag adszorbeálódik. Az adszorbeált fázist 500 ml metanolból és'500 ml pH 4,5 -ős acetát-pufferből, a metanolnak a pufferhez való folyamatos adagolásával létrehozott lineáris koncentrációgradienssel eluáljuk. A kívánt termék 40-50% metanol koncentráció körül elúálódik. Az eluátumot 100 ml térfogatú Diaion® MP 40 töltetű oszlopon az előzőekben leírt módon sómen-5 1C 15 20 25 30 35 40 45 50 55' 60 65 16
