187709. lajstromszámú szabadalom • Eljárás maláriaellenes antigén preparátum és vakcina előállítására
1 .187 709 2 dodecil-szulfát gél) elektroforézisnek vetettük alá, ahol az antigén 2,30* 105 látszólagos molekulasúlyú anyagként viselkedett. Emellett több dekradációs terméket is megfigyeltünk, melyek antigén determinánst tartalmaztak. A főbb töredékek molekulasúlya 1,97 x, 1,6 x ,1,51 x, 1,26 x ,0,90x, 0,56 x és 0,28 x 105 volt. Kisebb mennyiségben a 2,20x, 2,13 x, 1,90 x, 1,80 x, 1,74 x, 1,48 x, l,18x, l,12x és l,04x 10s molekulasúlyú degradációs termékek is voltak jelen. A 2. példa szerinti immunabszorbens oszlop-kromatográfiával tisztított antigén ugyanolyan degradációs termék skálát mutatott, mint az immunprecipitációval készült, 35S-metioninnal jelzett anyag. A polipeptidek közötti összefüggés természetét a nagyobb polipeptidek peptid-feltérképezésével és a Plasmodium yoelii schizonták radioaktív anyaggal való megjelölésével, majd ajelölt rész lecserélésével („pulse-chase”) állapítottuk meg. A főbb polipeptidek aminosav szekvenciái között homológiát egyértelműen ki lehetett mutatni a 25.1 antitesttel immunprecipitált, és 3SS-metioninnal jelölt polipeptidek kétdimenziós kimotripszines peptid térképezésével, és az SDS poliakrilamid gélekben peptidtérképezett, tisztított anyagok korlátozott fehérjebontásával, melyeket J125 izotóppal megjelöltünk. A Plasmodium yoelii schizontákat 10 percig inkubáltuk nagy fajlagos aktivitású 35S-metionin jelenlétében, melyet aztán inaktív mationinnal lecseréltünk. A mintákat a megjelölés után különböző időintervallumokban szolubilizáltuk és 25.1 antitesttel immunprecipitáltuk. A jelzőanyag kezdetben a 2,30 x 105 molekulasúlyú polipeptidhez kapcsolódott, de a további inkubációk során fokozatosan a kisebb polipeptidekben jelent meg, majd a jelzőanyag egyidejű csökkenésével a 230 000-es molekulasúlyú komponensben maradt. így a 25.1 antitest által felismert natív antigén egy 2,3 x 10s molekulasúlyú fehérje, és a kisebb polipeptidek ennek a bomlásából származó töredékek melyek mindegyike tartalmazza az antigén determinánst, melyet a monoklón antitest felismer. A natív fehérje in vitro degradációja annak szintézise után hamar bekövetkezik, és 7 óra múlva teljessé válik. Az eredmények azt mutatják, hogy a lebomlás inkább az érintetlen schizonták inkubációja alatt megy végbe, semmint a sejtbomlás (lízis) és a szolubilizáció után. Az antigéneknek és néhány töredékének az izoelektromos pontját úgy határoztuk meg, hogy egy kétdimenziós elektroforézis rendszert használtunk, melyet O’Farrell írt le (L.Biol.Chem. 250. 4007-4021, 1975). de az első dimenzióban vagy egy poliakrilamid gélt, vagy egy kevert agar-poliakrilamid gélt használtunk. 3-10 pH-ju amfolinek segítségével különböző pH gradienseket állítottuk be, ahol az antigéneknek illetve töredékeinek nagyjából a következő izoelektromos pontjai adódtak: 2,3 x 105 molekulasúly : 5,3—5,7 ; 1,6x10s mólsúly : 5,2-5,5; 1,5 x |05 mólsúly: 5,2-5,5; 0,9 x 105 mólsúly: 6,0-6,7; 0,56x 105 mólsúly: 5,2-5,4; és 0,30 x 105 mólsúiy; 5,0-5,3. A töredékek a hordozón vándorolva (lényegében az izoelektromos pontjuk függvényében) egy adott ponttól mérve, különböző távolságban helyezkednek el, mégpedig a következők szerint : legtávolabb a 0,28 x 105 mólsulyú, majd a 0,56x105, l,5x 105, l,6x 105,2,4xl05, végül a 0,9x105 molekulasúlyú töredék. A fehérjéknek a poliamid gélben a szokásos perjódsav Shiff festése, és Jl2S-ei jelzett Concanavalin A lektin kötődése egyaránt azt mutatja, hogy a fehérje nem glikolilezelt. A glikozilezés hiányát megerősítette az is, hogy az eluátumban levő fehérje nem volt képes specifikusan kapcsolódni a lentil lektin-Sepharose-hoz (lentil-extraktum, kovalens kötéssel Sepharose-hoz kötve) és a búzacsira agglutinin-Sepharose-hoz, továbbá az, hogy a fehérje méreteire semmilyen hatással nem volt, ha a paraziták a fehérje N-glikozilezését specifikusan gátló tunícamycin jelenlétében szintetizálták. 4. példa: A Plasmodium yoelii he: kapcsolódó antigén lokalizálása Indirekt immunfluoreszcencia alkalmazásánál, ha acetonfixált sejteket használunk, az antigén fehérje a schizonták illetve a merozoitok membránjához kapcsolódik. Sem a 25.1 antitest, sem pedig a több-értékű antiszérum, amelyet tisztított fehérje ellen hoztak létre, nem reagál a fixálatlan, érintetlen schizontákkal szuszpenzióban. A fehérjét nem lehetet t megjelölni az érintetlen schizonták laktoperoxidázzal katalizált jódozásával, de jelölhető volt ezzel a módszerrel, ha a sejteket először 0,01 térfogat %nyi Nonidet P40 hozzáadásával szolubilizáltuk. Továbbá, ha tripszint adtunk a közeghez (5 /tg/ml mennyiségben), ez nem befolyásolta a fehérje képződését, amit a parazitákkal fertőzött sejtek 3. példában leírt in vitro inkubációjánál megfigyeltünk, így azt a következtetést vontuk le, hogy fehérje nincs jelen a gazda sejt membránjának külső felületén, sem pedig ezen membrán belső felületéhez sem kötődik. A 25.1 antitestek által produkált 11F kép szerint a 2. példa szerinti 2,30 x 105 molekulasúlyú fehérje a sejten belül fejlődő parazita plazma membránjához kapcsolódik specifikusan, és nem pedig a gazda erythrocytájának membránjához. Ezt az elképzelést erősiti meg a dupla jelölésű immunfluoreszcens technika, ahol az acetonnal fixált schizontákat 25.1 antitest (egér immunglobulin) és nyúl anti-egér vörös vértest antiszérum eleggyel inkubáltuk. A lemezeket kimostuk, majd sorrendben rodamin-konjugált kecske anti-nyúl IgG antiszérummal és FITC (fluoreszcein-izotiocianát)konjugált nyúl anti-egér IgG antiszérummal inkubáltuk. A vizsgálat során kiderült, hogy a Plasmodium yoelii schizonta antigén (FITC-vel jelzett) olyan membránon helyezkedik el, amely különbözik a gazda vörös sejt membránjától (amely rodaminnal jelzett), de abba van bezárva. A fiatal schizontákban, a visszamaradó test képződése előtt, az antigén a parazitában bezárt gömbalakú membránhoz lokalizálva jelenik meg, de a visszamaradó test szegmentációját és képződését követően úgy tűnik, hogy a membrán körülveszi az egyedi merozoitokat. így a 2,3 x 105 molekulasúlyú fehérje (és/vagy ennek fehérjebomlásból eredő szár5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
