187390. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 3-oxo-delta1,4-szteroid-származékok előállítására
1 . 187 390 2 0,1 % élesztőkivonat, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. c) 7,5 g 17ß-hidroxi-17a-metil-4-androszten-3- ont feloldunk 150 ml dimetil-formamidban, majd az oldatot sterilre szűrjük. d) 12 g kobalt(II)-szulfát-víz (1/7) és 12 g ammónium-szulfát 500 ml vízzel készített oldatát előbb pH = 6,5 értékre beállítjuk, majd sterilizáljuk. e) 50 literes fermentorba beadagolunk 30 liter steril tápközeget, melynek összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, °.05% glükóz-monohidrát, 0,3 % protein-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 3 liter Arthrobacter simplex előtenyészettel /b) pont/, majd levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 'C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril 17ß-hidroxi-17a-metil-4- androszten-3-on-oldatot és a jelen példa d) pontja szerint készített oldatot, amely az adalékanyagokat tartalmazza. Ezután a fermentációt még 20 órán keresztül folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 5 liter etilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 20-20 liter etilén-dikloriddal extraháljuk. Az etilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 °C hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából alumínium-oxidon kromatografáljuk. Ily módon 6,2 g 17ß-hidroxi-17a-metil-l,4- androsztadien-3-ont kapunk, melynek olvadáspontja 163-164,5 *C. 12 12. Példa a) Arthrobacter simplex ATCC 6946 törzs száraz kultúráját leöblítjük és ezzel beoltunk egy kétliteres Erlenmayer-lombikban levő 1 liter steril tápközeget, melynek összetétele az alábbi: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, pH = 7 értékre beállítva. A beoltott táptalajt 30 'C hőmérsékleten 72 órán át 180 fordulat/perc sebességgel rázatjuk. b) 50 literes fermentorban 30 liter steril tápközeget beoltunk 1 liter fenti Arthrobacter simplex tenyészettel, majd ezt az előtenyészetet 30 *C hőmérsékleten levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 24 órán át inkubáljuk. A tápközeg összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0,1 % élesztőkivonat, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. c) 6 g lla,17a-dihidroxi-16ß-metil-4-pregnen-3,20-diont feloldunk 150 ml etilénglikolmonometil-éterben, majd az oldatot sterilre szűrjük. d) 12 g kobalt(II)-szulfát-víz (1/7) és 12 g ammónium-szulfát 500 ml vízzel készített oldatát előbb pH = 6,5 értékre beállítjuk, majd sterilizáljuk. e) 50 literes fermentorba beadagolunk 30 liter steril tápközeget, melynek összetétele: 0,5 % kukoricalekvár, 0,05% glükóz-monohidrát, 0. 3.% protein-hidrolizátum, 4 ml Silikon SH, 4 ml Pluronic, pH = 7 értékre beállítva. Ezt beoltjuk 3 liter Arthrobacter simplex előtenyészettel /b) pont/, majd levegőztetés (2 m3/óra) és keverés (220 fordulat/perc) közben 6 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor hozzáadjuk a tenyészethez a jelen példa c) pontja szerint előállított steril lla,17a-dihidroxi-16ßmetil-4-pregnen-3,20-dion-oldatot és a jelen példa d) pontja szerint készített oldatot, amely az adalékanyagokat tartalmazza. Ezután a fermentációt még 20 órán keresztül folytatjuk. A fermentáció befejezése után a kapott fermentátumot 5 liter etilén-dikloriddal stabilizáljuk, majd három ízben, alkalmanként 20-20 liter etilén-dikloriddal extraháljuk. Az etilén-dikloridos kivonatokat forgó bepárlókészülékben legfeljebb 50 °C hőmérsékleten vákuumban bepároljuk. Az anyagot ezután tisztítás céljából alumínium-oxidon kromatografáljuk. Ily módon 4,6 g lla,17a-dihidroxi-16ß-metil-l,4-pregnadien-3,20-diont kapunk, melynek olvadáspontja 203/204-205 °C. Az összehasonlítás céljából végzett kísérletek a következőket eredményezték: A 2. példa szerint eljárva, de kobalt(II)-iont nem alkalmazva csupán 0,7 g végterméket, valamint kb. 3,5 g ismeretlen összetételű mellékterméket kaptunk; a 6. kiviteli példát kobalt(II)-ion hozzáadása nélkül megismételve, reakció nem megy kellő mértékben végbe és körülbelül 60% kiindulási anyag változatlan marad; a 10. példa szerinti eljárást kobalt(II)-ion hozzáadása nélkül megismételve, csupán 20% mennyiségű eljárásterméket kapunk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás pregnán- vagy androsztán-vázas 3- oxo-AM-szteroid-származékok előállítására valamely 1,2-helyzetben telített pregnán- vagy androsztán-vázas 3-oxo-A4-szteroid-származékot Arthrobacter simplex mikroorganizmus élő tenyészetével fermentálva, azzal jellemezve, hogy a fermentációs közeg egy literjére számítva 0,04 g-0,12 g kobalt(II)-ion jelenlétében fermentálunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás pregnán- vagy androsztán-vázas 3-oxo-A1 4-szteroid-származékok előállítására, azzal jellemezve, hogy a fermentációt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 8
