187152. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklodextrin glikoziltranszferáz enzim immobilizálására
1 187 152 2 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 7,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a reakcióelegyet. A reakció kezdetén félóránként, később órénként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt centrifugálással elválasztottuk és háromszor 60 ml 0,05 mólos nátrium-acetát oldattal (pH = 7,5), háromszor 60 ml - 1 mól nátrium-kloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátrium-acetát oldattal (pH = 7,5), majd háromszor 60 ml nátrium-acetát oldattal (pH = 7,5) mostuk. Végül a gélt kétszer 200 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,3 g immobilizált CGTáz. Aktivitás: 370 Kitahata egység/g xerogél. 10. példa 0,26 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 10 ml 0,05 mólos nátrium-acetát oldatban (pH = 8,0) szuszpendáltunk, majd 0 °C-on - állandó kevertetés közben - hozzáadtunk 0,52 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfolinil)etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot, amelyet előzőleg 10 ml hideg ( + 4 *C) 0,05 mólos nátrium-acetát oldatban (pH = 8,0) vettünk fel. 10 perc további kevertetés után, a reakcióelegyhez 29 ml CGTáz oldatot (9,25 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 8,0-ra állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a reakcióelegyet. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt centrifugálással elválasztottuk és háromszor 60 ml 0,05 mólos nátrium-acetát oldattal (pH = 8,0), háromszor 60 ml - 1 mól nátriumkloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátrium-acetát oldattal (pH = 8,0), majd háromszor 60 ml nátrium-acetát oldattal (pH = 8,0) mostuk. Végül a gélt kétszer 200 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,3 g immobilizált CGTáz. Aktivitás: 300 Kitahata egység/g xerogél. 11. példa 0,26 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 6,2 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 10 ml 0,05 mólos nátrium-acetát oldatban (pH = 8,5) szuszpendáltunk, majd 0 °C-on - állandó kevertetés közben - hozzáadtunk 0,52 g N-ciklohexil-N'-[2-(4-morfoIinil)etil]-karbodiimid-metil-p-toluol-szulfonátot, amelyet előzőleg 10 ml hideg ( + 4 °C) 0,05 mólos nátrium-acetát oldatban (pH = 8,5) vettünk fel. 10 perc további kevertetés után, a reakcióelegyhez 29 ml CGTáz oldatot (9,25 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 8,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő - 0-4 °C-on - 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a reakcióelegyet. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a pH-t, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt centrifugálással elválasztottuk és háromszor 60 ml 0,05 mólos nátrium-acetát oldattal (pH = 8,5), háromszor 60 ml - 1 mól nátriumkloridot tartalmazó - 0,05 mólos nátrium-acetát oldattal (pH = 8,5), majd háromszor 60 ml nátrium-acetát oldattal (pH = 8,5) mostuk. Végül a gélt kétszer 200 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. Kitermelés: 0,4 g immobilizált CGTáz. Aktivitás: 173 Kitahata egység/g xerogél. /. táblázat Ciklodextrin glikoziltranszferáz immobilizálása Hordozó Immobilizáll fehérje (76) 1 Immobilizált aktivitás (76) Oldott állap« visszanyert aktivitás (76) Aktivitás veszteség (%! A termék aki (Kitahata eg: szárazanyag) Cellulóz A 26,8 0,1 6,4 93,5 26,5 Molselect A 26,9 0,1 13,5 86,4 13,6 Akrilex AH-C4 27,9 0,1 11,5 88,4 80,0 Akrilex C-100 39,4 3,84 63,0 33,16 450,0 2. táblázat A pH hatása a ciklodextrin glikoziltranszferáz enzim immobilizálására Akrilex C hordozó alkalmazása esetén A reakcióeleg; pH-ja Immobilizált fehérje (%) Immobilizált aktivitás (76) Oldott állapot visszanyert aktivitás (76) Aktivitás veszteség (76) A termék akti (Kitahata egy; xerogél) 5,0 36,6 0,75 38,9 60,35 147 5,5 26,0 1,20 40,0 58,80 235 6,0 36,0 3,25 78,0 18,75 380 6,5 39,4 3,84 63,0 33,16 450 7,0 47,4 1,83 41,0 57,17 366 7,5 48,8 1,93 73,0 25,07 370 8,0 52,0 0,50 43,0 56,50 300 8,5 53,5 0,39 50,6 49,01 173 12. példa 0,5 g Akrilex C-100 xerogélt, amelynek kötőkapacitása (—COOH-tartalma) 5,75 mekv/g, szemcsenagysága 100-320 pm volt, 25 ml 0,05 mólos nátrium-acetát oldatban (pH = 6,5) szuszpendáltunk, majd 0 °C-on, állandó kevertetés közben hozzáadtunk 0,45 g N-etil-N'-[3-(dimetil-amino)propilj-karbodiimid-hidrokloridot, amelyet előzőleg 10 ml hideg ( + 4°C-os) 0,05 mólos nátriumacetát pufferben (pH = 6,5) oldottunk fel. 10 perc további kevertetés után a reakcióelegyhez 51 ml CGTáz oldatot (9,87 mg/ml) adtunk, majd a reakcióelegy pH-ját 6,5-re állítottuk. A teljes reakcióidő 0-4 °C-on 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órát kevertettük a szuszpenziót. A reakció kezdetén félóránként, később óránként ellenőriztük a közeg pH-ját, és szükség esetén korrigáltuk. A reakció befejeződése után a gélt centrifugálással elválaszt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
