186970. lajstromszámú szabadalom • Eljárás emberi kötőszövetsejthez adaptált hepatitisz A-vírus előállítására
2 136970 3 A találmány tárgya eljárás hepatitisz A-vírus adaptálására emberi kötőszövetsejtekhez és kívánt esetben a kapott hatóanyag további kikészítésére diagnosztikai, illetve terápiái preparátummá. A hepatitisz-vakcinák előállításával kapcsolatos kutatások során ismeretessé vált olyan eljárás, amely hepatitisz A-vírusok (továbbiakban: HAV) jó kitermeléssel való előállítását teszi lehetővé. A P 30 33 406.6 sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés ismerteti az első olyan eljárást, amellyel gyorsítani sikerül a HAV növekedését annak révén, hogy Rhesus-majom vesesejtjeit [FrhR-4/R] beoltanak HAV-val, a néhány hét múlva megjelenő vírusokat kinyerik és újra beoltják. Ezt a folyamatot mindaddig megismétlik, amíg a vírusok kielégítő növekedési sebességet mutatnak. Az idézett eljárás szerint kapott HAV azonban nem alkalmas a humán gyógyászatban használható vakcinák készítésére, hiszen állati sejt eredetű. A találmány kidolgozásával olyan HAV előállítása volt a célunk, amely a humán gyógyászatban (diagnosztika, terápia) felhasználható. A találmány szerint emberi magzati vescsejteken (továbbiakban: MENZ) át adaptáljuk a hepatitisz A- vírusokat (HAV) emberi kötőszövetsejtekhez (MEZ), úgy hogy az ilyen adaptálást a HAV/MENZ/MFZ kapcsolat jellemzi. Ilyen vírust nekem sikerült először előállítanom a következőképpen: Székletből elkülönítünk HAV-t és azt MENZ-ben tenyésztjük. Magát a tenyésztést ismert módszerrel végezzük, pl. azzal a módszerrel, amelyet a már idézett P 30 33 406 sz. NSZK szabadalmi bejelentésben ismertetnek. Az első, kb. 7—8 hét után szabaddá váló vírusokat arra használjuk, hogy ismét fertőzzük azzal a MENZ-közeget (2. passzázs MENZ-ben). Ezt a folyamatot mintegy tíz passzázsra kiterjedően megismételjük, miközben a növekedési sebesség mindenkor növekszik. Az első MENZ-passzázsban 34 nap után sikerült a sejtzárványban megbízhatóan kimutatni a szabaddá vált vírust, a 10. passzázsban már a 6. napon. A gyorsan és nagy tömegben növekvő vírusokat lépésenként elkülönítjük. Ilyen módon kapunk először MENZ-ben adaptált HAV-t: HAV/MENZ. Ebben a folyamatban kifejezetten meglepőnek tekinthető, hogy 1. egyáltalán nyerhetünk vírusokat viszonylag nagy időtartam után. A szokásos növekedési sebesség lényegesen nagyobb, így már igen rövid időtartam után valószínűtlennek tekinthettük az ilyen folyamat fellépését; 2. á MENZ-hez való adaptálás nagy növekedési sebességgel, többszörös passzálással érhető el. E viszonyok megismétlődését tapasztaljuk, amikor a fentiek szerint kapott HAV/MENZ közeggel emberi kötőszövetsejteket (MFZ) fertőzünk. Itt is kifejezetten lassú a növekedés az első passzázsban (28 nap), a későbbi siker (10. passzázsban 6 nap) tehát ebben az esetben is meglepő. A HAV/MENZ többszöri passzálása MFZ-n végül is MFZ-hez adaptált HAV-t, vagyis: HAV/MENZ-MFZ-t eredményez, amelyet akár a sejtből, akár a táptalajból kinyerhetünk és adott esetben közvetlenül, más esetben további kikészítéssel — tisztítás, inaktiválás, a szakterületen szokásos hordozó-, illetve kötőnyagok alkalmazásával — nyert preparátum alakjában felhasználhatunk HAV-antitest tesztekhez is, mindenekelőtt azonban a humán gyógyászati oltóanyagok előállításához. Ha a sejtből nyerjük ki a vírust, pl. fagyasztás és azt követő felengedés háromszori ismétlésével vagy ultrahangos kezeléssel (ezeket a módszereket a szakirodalom kielégítő mértékben ismerteti), akkor a sejteket a kezelés során véglegesen szétroncsoljuk, így további tenyésztésre azok már nem alkalmazhatók. Ennél egyszerűbb is, célszerűbb is a sejtzárványból való kinyerés oly módon, hogy a tápoldatot kivonjuk a sejtből és új tápközeggel pótoljuk, így a sejteket nem roncsoljuk szét, hanem fenntartjuk további tenyésztés céljából. A kivont tápközegben jelen lesz a tenyésztett vírus. A HAV/MENZ/MFZ-t kizárólag emberi sejteken tenyésztettük, így kizárt az a lehetőség, hogy esetleg állati sejtekből szabaddá vált állati vírusok vagy daganatos sejtekből szabadddá vált Onc-gének ezt a vírust fertőzik. Ezért a találmány szerint adaptált vírusok különösen alkalmasak arra, hogy egyfelől diagnosztikai tesztekben hasonló módon alkalmazzuk azokat, mint az emberi székletből elkülönített vírusokat, másfelől kiindulási anyagként alkalmazzuk vakcinák előállítására, amely vakcina lehet akár elölt mikroorganizmust, akár legyengített virulenciájú élő mikroorganizmust tartalmazó vakcina (továbbiakban: „holt-vakcina”, illetve „élő-vakcina”). Az ilyen vakcina előállítása történhet az ún. Polio-oltóanyagokéhoz hasonló módon. A találmányt részletesebben példákkal ismertetjük, amelyekben csak a találmány szerinti intézkedéseket részletezzük, „általánosan ismert”-ként utalunk olyan körülményekre és műveletekre, amelyek az adott szakterületen jól ismertek és amelyekre nézve kielégítő útmutatás nyerhető egyebek között a már idézett, P 30 33 406.6 számmal közzétett NSZK szabadalmi bejelentés, illetve az általam a Medical Microbiology and Immunology (Springer-Verlag 1981) 170: 73—81. oldalain publikált cikk, továbbá az ebben a cikkben általam idézett korábbi források tartalmából. 1. példa Emberi magzati vesesejtek (MENZ) és emberi magzati kötőszövetsejtek (MFZ) előállítása A MENZ-t emberi magzati veséből, az MFZ-t emberi magzati tüdőből állítjuk elő. A szervek feldolgozását általánosan ismert körülmények között végezzük. A MENZ első monolayer rétegét szub-passzázshoz 5—10- szer használhatjuk, MFZ esetében kb. 50—75 a lehetséges szub-passzázsok száma. Akár MENZ, akár MFZ esetében a kezdeti passzázsokban nyert termékek egyrészét önmagában ismert módon befagyaszthatjuk —70 °C hőmérsékleten vagy folyékony nitrogénben és szükség szerint később újra felolvaszthatjuk és alkalmazhatjuk. Az első MENZ-szubpasszázs tartama 28 nap, a tizediké 6 nap. Az MFZ-szubpasszázsok tartama megfelelően 28, illetve 10 nap. 2. példa HAV tenyésztés MENZ-n és MFZ-n 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
