186928. lajstromszámú szabadalom • Immunokémiai reagens-készítmény
7 186928 8 Az így kapott reagens-készítmény alkalmazásával hagyományos módon meghatározhatjuk az immunológiai reakciót. Ha pl. szemrevételezéssel kívánjuk figyelni az immunológiai reakciót, a reagens-készítményből és az antigént vagy antitestet tartalmazó mintából előre meghatározott mennyiségeket keverünk össze Uveglapkán vagy kémcsőben és figyeljük a szenzibilizált részecskék agglutinációját. Ha pedig optikai méréssel kívánjuk meghatározni az immunológiai reakciót, ugyancsak előre meghatározott mennyiségi arányokban keverjük össze a reagens-készítményt az antigént vagy antitestet tartalmazó mintával és a fényáteresztés, a fényszóródás ,' illetve a zavarosság változásának mértékét mérjük optikai cellában. Ha az optikai mérés célja a fényáteresztés meghatározása, a fény hullámhossza általában legyen a hordozó átlagos részecske-átmérőjének legalább 1,1-szerese, előnyösen legalább 1,5-szerese, leginkább több mint 2-szerese. Általában a hullámhossz tartománya 600 és 2400 nm, előnyösen 800 és 1800 nm közötti. Ha a fény hullámhossza ennél kisebb, megfelelő fényáteresztés csak akkor érhető el, ha az alkalmazott szemcsés hordozónak elég kicsi a koncentrációja és olyan reagens-készítményt alkalmazunk, mely kiemelkedően jól diszpergálható, ezért kis hullámhosszon nehéz a kívánt érzékenység elérése és egyes esetekben a reakció viszszájára fordulhat. Túl nagy hullámhossz választása sem célszerű, mert akkor csökken az érzékenység. Az alkalmazott fény lehet akár egyszínű, akár többszínű. A fényáteresztés mérésénél alkalmazott optikai cella a szokásos vastagsága 0,2 és 10 mm közötti. A fényáteresztést mérhetjük úgy, hogy meghatározzuk az előre választott abszorpciós érték eléréséhez szükséges időtartamot, s úgy is, hogy előre megválasztott időtartamra meghatározzuk az abszorpció növekedésének mértékét. A fényszóródás meghatározására szolgáló optikai mérés is a fényáteresztéssel kapcsolatban fent megadott módon végezhető. A találmány szerinti reagens-készítmény tehát szenzibilizált szemcsés reagenst tartalmaz, melynek révén az immunológiai reakciókban meghatározható az antigén vagy antitest mennyisége különböző mintákban, nagy pontossággal és jó reprodukálhatósággal. Külön előny, hogy a reagens akkor is hatékony, ha a készítményt előzőleg fagyasztottuk, majd újra felolvasztottuk, így a reagens-készítmény liofilizálható és újra használható. A fentiekben adott általános ismertetés után néhány példával szemléltetjük részletesebben a találmányt, amely példákra a találmány nem korlátozódik. A példákban szereplő adatok közül a vezetőképességet hagyományos módon mértük, CM-6A tip. konduktométerrel (Toa Dempa Kogyo terméke). A szenzibilizáltság kívánt értékének elérését és az oldat stabilitását az általános ismertetésnél már leírt optikai mérés alkalmazásával felügyeltük; a szenzibilizálás a konkrét példától függően eltérő időtartamot igényelt, 10 perc és 2 óra közölt. 1. példa a-Fetoproteinnel szemben antitest hatású globulint feloldunk 0,1 M glicines pufferben (pH = 8,8). Az oldatot ezután azonos mennyiségű látex-glicines pufferrel (pH = 8,8) szobahőmérsékleten összekeverjük, a keverést addig folytatva, amíg a szenzibir lizáltság kielégítő. Minden egyes lálex részecskén (átmérő; 0,220 pm, gyártó; Dow Chemical) az antitest globulinok száma 800 és 1500 közötti. Centrifugális szeparálás után a felülúszót eltávolítjuk, majd a csapadékot látex részecskénként 5000-10000 molekulányi marhaszérumalbuminnal kezeljük. Az így kapott szenzibilizált részecskéket 1,5 mS/cm vezetőképességű 0,1 M pufferoldatban szuszpendáljuk, amely 0,05%-ban nátrium-azid tartósítószert tartalmaz, majd a szuszpenziót tároljuk. A kapott reagenskészítmény alkalmazásával végzett meghatározás kiemelkedően nagypontosságunak bizonyult. A reagens-készítményt hígítva használjuk immunológiai reakció meghatározására. A hígításhoz 1,5 mS/cm vezetőképességű 0,1 M glicines puffert használunk (pH = 8,6). A meghatározás eredményeiből a kísérletsorozaton belül kapott értékeket az 1. táblázat mutatja, a tárolási napok szerint kapott értékeket a 2. táblázat. 2. példa Anti-CRP (C-reaktiv protein, amely humán szérumban van jelen és amelyet pneumonia coccus-ban levő C-poliszahariddal kicsapatunk) antitestet feloldunk 0,2 M borátos pufferoldatban (pH = 8,8). Az oldathoz látexet keverünk (átmérő: 0,22 gm, gyártó: Dow Chemical) és azt úgy szenzibilizáljuk az eredő oldatban, hogy minden egyes látex részecske 800 és 1800 közötti antitestet hordozzon. Az így szenzibilizált látex részecskéket - látex részecskénként 3000- 6000 molekulányi - marhaszérumalbuminnal kezeljük és az elegyet 0,05 M borátos pufferoldatban diszpergáljuk, amelynek térfogata az elegy térfogatának négyszerese, míg az eredő vezetőképesség: 4,0 mS/cm. A kapott reagens-készítmény kiemelkedően nagy meghatározási pontosságot biztosít, szemben a már említett technika állása szerinti (meghatározott hullámhosszúságú fénysugarat és részecskemérerű hordozó részecskéket 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
