186868. lajstromszámú szabadalom • Fermentációs eljárás 9-hidroxi-3-oxo -4,17(20)-pregnadién- 2O-al előállítására
1 . 1,46868 . 2 szempontjából hasonló, vagy azonos azzal. Mindkét M. fortuitum tenyészet savtűrő, nem mozgékony, nem spórázó bacilus, az Actinomycetales rendjének Mycobacteriaceae családjába tartoznak. Runyon osztályozása szerint (Runyon, E. H.: Med. Clin. North America 43, 273, (1959) ez a IV. csoportba tartozó nem homogén mycobaktérium, azaz viszonylag egyszerű táptalajon, alacsony hőmérsékleten pigment nélküli telepeket fejlesztve gyorsan nő. A M. fortuitum NRRL B-8119 és az NRRL B-12 433 az Amerikai Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériumának Északi Regionális Kutató Laboratóriumában (Peoria, Illinois állam) van deponálva. A M. fortuitum a nyilvánosság számára legalább a korábban említett, a mikroorganizmust ismertető amerikai egyesült államokbeli szabadalmak publikálása óta hozzáférhető. A M. fortuitum NRRL B-12433 deponálásának ideje. 1981. május 4. Ebből a mikroorganizmus törzsből származó mutánst bárki kaphat a törzsgyűjteményből. Az (I) képletű vegyület értékes kortikoidok szintézisében használható köztitermék. Például a megfelelő savvá oxidálható, azaz 9-hidroxi-3-oxo- 4ri7(20)-pregnadién-20-karbonsav állítható elő belőle, mely a 79 104 372.2 számú európai szabadalmi bejelentésben részletesen ismertetett eljárás szerint hidrokortizon-acetáttá alakítható. A következő kiviteli példákkal a találmány szerinti fermentációs eljárást kívánjuk megvilágítani. Ha más megjelölés nem szerepel, a százalékok minden esetben súlyszázalékot, az oldószerelegyek arányai térfogatarányokat jelentenek. 1. példa. Nyers szitosztérin fermentációja A fermentációs táptalaj literenként 8,0 g Ucont (aktív anyagként_ polipropilénglikolt tartalmazó szintetikus habzásgátíó, a Union Carbide, New York, USA terméke), 5,0 g Cereloset (nyers glukóz, a Corn Products, USA terméke), 3,0 g ammóniumkloridot, 3,0 g kalcium-karbonátot, 3,0 g trinátrium-citrát-dihidrátot, 2,0 g Tween 80-at, 1,0 g szójalisztet, 0,5 g kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,5 g karbamidot és 30 g nyers szitoszterint tartalmaz csapvízben, a pH-t 7,0-ra beállítva. E táptalaj 100 ml-es adagjait 10-10 ml, a következő módon készült tenyészettel oltjuk be: literenként 8,0 g peptonos húslevest, 5,0 g glicerint, 1,0 g élesztőkivonatot, 1,0 g Tween 80-at tartalmazó, desztillált vízzel készült, pH 7,0-ra beállított táptalajt M. fortuitum NRRL B-12 433-mal beoltunk és 28 °C-on tenyésztjük. Az előbbiekben leírt, 110 ml tenyészetet tartalmazó lombikokat rázógépre helyezzük és 28 *C-on 336 órán át inkubáljuk. Az inkubációt követően az elegyet extraháljuk, és a terméket a következőkben leírásra kerülő 3. példa szerint izoláljuk. 2. példa Megfelel az 1. példának, de a táptalajhoz szubsztrátként egyenként vagy együttesen tiszta vagy nyers szterineket adunk. Ilyen szubsztratok lehetnek a szitoszterin, koleszterin, sztigmaszterin és kampeszterin. -3. példa. (I) képletű vegyület kinyerése M. fortuitum NRRL B-12433 fermentációjából származó ferment léből A szitoszterinnek M. fortuitum NRRL B-12 433-mal történő biológiai átalakításából származó fermentlevet megsavanyítjuk, majd azonos térfogatú metilén-kloriddal kétszer extraháljuk. 29,2 g és 8,9 g nyers kivonatot nyerünk. Az első extraktumot metilén-kloridban újra oldjuk, és a savas komponensek eltávolítása érdekében telített nátrium-hidrogén-karbonát oldattal mossuk. A maradék semleges anyagot az oldószer eltávolítása után barna olajként nyerjük ki, súlya 18,6 g. Ez az anyag vékonyréteg- és folyadékkromatográfiás vizsgálatok tanúsága szerint három fő UV- elnyelő zónát tartalmaz. Ezek közül a legkevésbé poláros az (A) és (B) képletű metil-észterek keveréke, mely keverékben a (B) képletű metil-észter van túlsúlyban. A legpolárosabb a (C) képletű 9,22-dihidroxi vegyület, a közepes polaritású vegyületet 9-hidroxi-3-oxo-4,17(20)-pregnadién-20-karböxaldehidként azonosítottuk, (I) képlet, a következők szerint. Szilícium-oxid oszlopon végzett előkromatográfiával (I) képletű aldehidben dúsított frakciót nyerünk. Az oszlopot 30% etil-acetátot tartalmazó metilén-kloriddal eluáljuk. Az így nyert 3,3 g tömegű anyagot három előre töltött, sorba kötött Lobar szilikagél oszlopon (B méret, E. Merck Co.) gondosan újrakromatografáljuk, eluensként 20% etilacetátot tartalmazó metilén-kloridot alkalmazunk. 1,05 g színtelen, etil-acetát, metilén-klorid elegyből tű alakú kristályok formájában kiváló (I) képletű aldehidet nyerünk, melynek olvadáspontja 194-212 °C, (a)D + 96° (c, 1,024; CHC13). Elemzés a C22H30O3 képlet alapján: számított: C, 77,16%; H, 8,83%; talált: C, 77,53%; H, 8,71%. A tömegspektrumban szerepel egy molekulaion 342 m/e értéknél (alapcsúcs) és nagyobb iontöredékek 324, 309, 295, 191, 136 és 124 m/e értéknél. H-NMR spektrum: 1,02 (18-CH3); 1,36 (19-CH3); 1,82 (21-CH3); 5,88 (4-H); 10,04 (CHO) PPm. IR-spektrum: 3497, 3440 cm'1 (—OH); 1663 cm-1 (a,ß telítetlen karbonil); 1622, 1617 cm-1 (C=C). UV-spektrum: A.ma> 250nm; (e, 27900; metanol) Szabadalmi igénypontok 1. Fermentációs eljárás az (I) képletű vegyület előállítására, azzal jellemezve, hogy Mycobacterium fortuitum mutánst, előnyösen a Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 törzs egy mutánsát, különösen előnyösen a Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 törzset tenyésztjük vizes táptalajban, aerób körülmények között, szterin jelenlété5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
