186864. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tiszta hepatitis B felületi antigén előállítására humán plazmából
. 186864. 2 A találmány tárgya eljárás tiszta hepatitis B felületi antigén (HBsAg) előállítására humán plazmából. A^ HBsAg olyan virus fehérje, amely B típusú fertőző májgyulladásban szenvedő emberek vérében, illetve azoknak a vérében jelenik meg, akik a hepatitis B vírus hordozói. A plazmától megtisztított HBsAg fertőző hepatitis B elleni vakcinaként alkalmas, amelyet, ha embernek vagy állatnak beadnak, a kezelt egyednél HBs antitestek termelését indítja meg. Ezek az antitestek megvédik a szervezetet az olyan fertőzésektől, amelyeket a hepatitis B virus fertőzésben aktív részecskéi okoznak. Ismert egy eljárás a tiszta HBsAg előállítására megfelelően előkészített plazma szacharóz- vagy cézium-klorid fajsúly gradiens centrifugálásával (3636 191 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). Ezzel az eljárással a HBsAg maradék plazma-proteinektől mentesen állítható elő. Az ultracentrifugálás azonban igen időigényes módszer, sok drága berendezés szükséges hozzá. Ismeretesek további eljárások HBsAg előállítására, ahol az enzimes kezelés után gélszürést, affinitás kromatográfiát, majd elektrofokuszálást végeznek [Jeansson S., Vesterberg O., and Wadstrom T.: Separation of Australia antigen by isoelectronic focusing in acrylamide gel. Life Sei. 11, 929-937 (.1972); Luzzio A. J.: Isolation and purification of hepatitis B antigen by elertrochromatography. J. infect. Dis. 131,,359-366 (1975); Shiraishi H„ Sukeno N., Shiraishi R. and Ishida N.: Affinity chromatography of hepatitis B antigen, Tohoku J. exp. Med. 113, 393-394 (1974)]. Ezek a módszerek azonban nem teszik lehetővé, hogy teljesen tiszta antigént állítsunk elő, és amellett kicsi a produktivitásuk. A Vox Sang. 31, Suppl. I. 84-95 (1976) helyen olyan eljárást ismertetnek, amellyel a HBsAg-t poiictilén-glikollal kicsapják, a plazmafehérjéket pepszines emésztéssel eltávolítják, a lipoproteineket Tween 80-nal végzett kezeléssel eltávolitják. A 2621 276 sz. NSzK közrebocsátási irat szerint a proteinek eltávolítását karbamidos kezeléssel végzik. Kísérleteink során kidolgoztunk egy, az ismerteknél olcsóbb és egyszerűbb módszert a HBsAg tisztítására. A találmány szerinti eljárás abban áll, hogy a kiindulási anyagot, melyet előzőleg lipidektől és humán plazmától részben megtisztítottunk, 0,01-0,50 mg/mg fehérje mennyiségű, előnyösen 0,05 mg/mg fehérje mennyiségű pepszinnel emésztjük, foszfáttal 7,1-7,3 pH értékre pufferolva olyan molekulaszűrőn szűrjük át, amely a 100000 Daltonig terjedő molekulákat átengedi, fertőzőképességét l : 2000 térfogatarányban vett formaldehiddel inaktiváljuk. A találmány szerinti eljárás, az ismert eljárásokkal szemben lehetővé teszi, hogy a HBsAg-t teljesen megtisztítsuk a plazma fehérjéktől. Ha az így előállított antigént B típusú fertőző májgyulladás elleni vakcinaként beadjuk, a vakcináit személyeknél semmiféle mellékhatást sem okoz. A találmány szerinti eljárás vakcina hepatitis B vírus fehérjét tartalmat ő plazmából nagy mennyiségben történő clőállitáíára is használható. . A tiszta hepatitis B felületi antigén előállítását a talá nány értelmében a következőképpen végezzük. Eh 3 lépésben a humán plazmát megtisztítjuk a lipidektől. Ebből a célból 1000 ml olyan plazmát nyerünk HBsAg-donoroktól, amely plazmának immuno-elektroforézis módszerrel megállapított titer re legalább 1:10 és ehhez 1000 ml 0,1 mólos MnClj • 4H20 oldatot adunk. A mangán-klorid adagolása után a plazmát elektromágneses keverővei jégfurdőn 1 óra hosszat keverjük, majd 6000 ford/perc sebességgel 30 percig centrifugáljuk. A centrifugálás után a csapadékot, amely nem tartalmaz HBsAg-t, eldobjuk. A centrifugálás után nyert felülúszó pH-ját 0,1 n sósavval 5,6-ra állítjuk be, és 1000 ml.-enként 75 g polietilénglikol 6000-t (PEG 6000) adunk hozzá. Ezután az elegyet kb. 12 óra hosszat keverjük 4 *C-on elektromágneses keverővei, majd 30 percig centrifugáljuk 6000 ford/perc sebességgel. A felülúszót, amely nem tartalmaz antigént, eldobjuk, és az eljárás további lépéseiben a centrifugálással nyert üledéket dolgozzuk fel. Az előbbi üledéket 200 ml 0,9 %-os nátriumkloridban feloldjuk és ionmentes vízzel a centrifugálás előtti térfogatra egészítjük ki. A nátriumklorid hozzáadása után újból csapadék válik ki, 30 percig 6000 ford/perc sebességgel végzett centrifugálással elkülönítjük a felülúszót, amely a HBs antigént tartalmazza, az üledéket eldobjuk. Ionmentes vízzel a folyadéktérfogatot 10 000 ml-re egészítjük ki. A hígítás után képződött csekély üledéket 30 percig 6000 ford/perc sebességgel végzett centrifugálással elválasztjuk. Az eljárás további lépéseiben az így kapott folyadékot használjuk. 10000 ml folyadékot felmelegítünk mintegy 37 *C-ra, pH-ját 2,5-re állítjuk be 1 n sósavval, és pepszint adunk hozzá 0,05 mg/mg fehérje mennyiségben. Az oldat fehérjetartalmát spektroszkópiás módszerrel mérjük meg. Kb. 1 óra múlva 1 n nátrium-hidroxid adagolásával a pH-t 4,6-ra állítjuk be, így a pepszines emésztést leállítjuk. Ezután az oldatot 30 percig 6000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A kapott üledékben HBsAg nem mutatható ki, a teljes mennyiség a felülúszóban található. A pepszinnel végzett emésztés következtében a humán plazma-fehéijék olyan protein-darabokra bomlanak, melyeknek mérete nem haladja meg a 30000 Daltont. A HBsAg azonban nem emésztődik. Ezután a pepszinnel emésztett plazma-fehérjéket olyan molekulaszűrővel távolítjuk el az oldatból, amely a 100000 Daltonig terjedő részecskéket átengedi. Erre a célra az AMICON Co. (USA) által gyártott zárt ciklusú szűrőberendezést használjuk, amelyben a szűrendő folyadék többször átáramlik a szűrőzónán, ahol egy molekulaszűrő-rétegen a kisméretű részecskék átjutnak. A találmány szerinti eljárásban a H 1 x 100 típusú szűrőt alkalmazzuk, amely a 100000 Daltonig terjedő részecskéket átengedi. A teljes szűrési ciklus a 80 1 térfogatú anyag kilencszeri 0,63 atm nyomáson végzett átszivattyúzásából áll. A szűrendő anyagot a szűrőbe töltés 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
