186823. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergotamin parazita úton való előállítására
1 2 '186523 1981. október 8-án az Országos Közegészségügyi Intézetben 00207 szám alatt deponáltuk. A kiindulási Bk4 jelű törzsből a morfológiai szempontok figyelem- 5 bevételével küllemileg megfeleld, nagyméretű, simafelületű szkleróciumokat választottunk ki. A kiemelt több száz szkleróciumot vékonyrétegkromatográfiás módszerrel analizáltuk. A vizsgálati eredmények alapján azokat az egyedeket emeltük ld, amelyek a legtöbb ergotamint és a legkisebb szennyező mellék- 10 alkaloidot tartalmazták. A szkleróciumokból steril darabkákat oltottunk 10%-os maláta-agar táptalajra. A kifejlett tenyészeteket 1200-1500 Cray dózisú rádióaktív gamma-sugárzásnak vetettük alá, amely sugárdózist 12-15 óra alatt juttattunk a tenyészetekhez. Ezt követően a tenyészetekből 10%-os maláta- 10 -agar táptalaj felületre szélesztést végeztünk. A sugárzást túlélt konidiumokból telepek fejlődtek, melyeket a spórázási készség és a morfológiai szempontok alapján szelektáltunk. A kiválasztott telepek mikroszkópi vizsgálattal ellenőrzött spóráiból szubmersz 2Q - tenyészeteket készítettünk maláta-kivonat, szaharóz és Stoll-féle tápsókat tartalmazó táptalaj felhasználásával. A folyadékkultúrában legjobban spórázó tenyészetek életképességét, virulenciáját üvegházi kísérletekben ellenőriztük. Izolált körülmények között, antézis előtti állapotban lévő rozsnövények kalászait 25 fertőztük, s az így legjobb fertőzési eredményt adó spóratenyészetek felszaporított spóráit vittük szabadföldi kísérletbe. Az egyforma méretű parcellákat azonos spóraszámmal fertőztük. A további kiválasztásnál a parcella terméseredményét és a drogergotamin tartalmát vettük figyelembe. A legtöbb ergota- 30 mint tartalmazó drogból válogattuk ki a továbboltásra kijelölt szkleróciumokat. A szelekciós munkát - a fenti kiválasztási szempontok figyelembevételével - további 2 éven át folytattuk. Az új törzset, amelynek intézeti jelzése ok Bk4/S/64/1981. 1981. október 8-án az Országos Közegészségügyi intézetben 00208. szám alatt deponáltuk. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentádóban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: • Új törzs Régi törzs Intézeti jelzése OKI deponálási száma OKI deponálási ideje Fermentlé spóraszáma (spóra/mm3) Bk4/S/64/1981 00208 1981.okt8. 6-7-10a Bk4/74/22/ 00207 1981.okt8. 3-4-10* Tartósított oltóspóra csiraképessége % 95-99 90-95 Virulencia % 80-90 50-60 Ezerszkleródumtömeg (g) 211 185 Terméseredmény (kg/ha) 280-350 150-200 Ergotamin hozam (g/ha) (átlag kg/ha x átlag mg/g) ' 2250 700 Mellékalkaloidok, szennyezések (az ossz alk tartalom %-ában) 0,5 alatt 7-8% Zsírolajtartalom % 18-20 20-22 A találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergotamin parazita úton való előállítására, Oaviceps purpurea törzs űj variánsával. Az anyarozs alkaloidok előállításának két eltérő módja ismeretes; a termesztett drog extrakdóján alapuló eljárások, illetve a steril fermentádós alkaloidtermelés Oaviceps törzsekkel. A steril fermentádós alkaloidtermelésre ismeretes eljárások (150.631, í51.724, 152 2 39, 164816. lajstromszámú magyar szabadalmi leírások), ennek ellenére a drogtermesztés nem vesztette el jelentőségét s a világ peptídalkaloid termelésének jelentős hányada mindinkább a különböző alkaloidféleségekre dúsított drogot használja fel. Különösen érvényes ez az ergotamin és az ergokrisztin termelését illetően. Az ergolénvázas alkaloidokat termelő Oaviceps purpurea törzs előállítása több korábbi szabadalomnak is tárgya,amelyekben változó módszerekkel igyekeztek magasabb hozamú törzsekhez jutni. így a 232.648. sz. szovjet szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, amelyben az ergotoxin előállítás céljára spóramérettel és telepmorfológiával jellemezhető Claviceps purpurea törzset állítottak elő. A 155.148.lajstromszámú magyar szabadalmi leírás eljárása szerint spedáüs táptalajon, a telep színe alapján lehet ergotamin termelésre képes törzseket előállítani. A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az ergotamin parazita úton való előállítására, amelyben a parazita Oaviceps purpurea törzs új variánsa- mesterséges táptalajokon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik,- spórái jól tartósítható,- spórái életképesek és virulensek, újra tápközegbe juttatva 90-95%-ban kicsíráznak és rozsra juttatva azt fertőzik,- magas droghozamot biztosít,- a drog főalkaloidként 99,5%-ban ergotamint tartalmaz és a főalkaloidon kívül csak jelentéktelen szennyezést. Az új törzs előállítását, a mutádót elősegítő sugárkezelés, valamint a szelekdós nemesitési mód alkalmazásával végeztük. A kiindulási Bk4/74/22/jelű ergotaminos törzset 2
