186734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás peptidek enzimatikus előállítására
1 I SO 734 2 ségben) a Merck cégtől (Darmstadt, Néniét Szövetségi Köztársaság) szereztük be. Valamennyi, aminosavat, aminosav-amidot és származékait a Sigma Chemical Company (St. Louis, Amerikai Egyesült Államok) gyártotta. A karbobenziloxi-fenilalanin-metilésztert (Z-Phe-OMe) Yamada eljárása szerint [Esterification of N-(benzoyloxycarbonil)-amino acids and amino acids using BF3-etherate as catalyst, Bull. Chem. Soc. Japan 51, 1897-1898, 1978] állítottuk elő és szirupként alkalmaztuk. A fenilalanin-hidrazidot és alanin-hidrazid-hidrokloridot észterből Lossc és társai módszere szerint (Racematspaltung von Aminosäureamiden und hidraziden, J. Prak. Chemide, 4, Reihe, Band 8, 345-350, 1959) készítettük. A nemkorrigált olvadáspontok 86- 88 °C (irodalmi: 82—83 °C, lásd utóbbi irodalmi utalást) és 182-185 °C (irodalmi: 184-185 °C, Zeller, E. A., L. A. Blanksma, J. A. Carbon, Ueber die Wirkung von optisch aktiven Hydraziden auf die Diaminoxydasc, Hclv. Chim. Acta. 40, 257—260, 1957). Az aszparagin-amid-dihidrokioridot aszparaginsavból dietii-észteren át - hagyományos aminolízissel — Fischer módszere alapján (Ueber die Ester der Aminosäuren. Chem. Ber. 34, 433-454, 1901) állítottuk elő. Az olvadáspont 210- 214 °C, irodalmi: 214-215 °C (Smith E. L„ D. J. Spackman; Leucine aminopeptidase V. Activation specificity and mechanism of action, J. Biol. Chem. 212, 271-299, 1955). A többi kiindulási anyagot a fenti cégektől vásároltuk vagy analóg módszerekkel állítottuk elő. A kitermelés meghatározása A termék tisztaságát szilikagél 60 F254-en (Merck) vékonyréteg-kromatográfiávai határoztuk meg. Az alkalmazott oldószerrendszer CHC13/CH3(CH2)0H/CH3C00H/H20(11:5:2:1) és a foltokat fluoriméterrel határoztuk meg. A reagensek kvantitatív meghatározására nagynyomású folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmaztunk és a Hewlett Packard 1084 kromatográfot egy változtatható hullámhosszúságú UV detektorral láttuk el (Model 79 875 A). Az elkülönítéshez 10 mmólos nátriumacetátban levő, 10-100 % CH3CN eluáló rendszer (pH 4) megfelelő specifikus gradiensét alkalmaztuk. Ezt a rendszert alkalmaztuk például a Bz-AIa-Gly-OH, Bz-Ala-Ala-OH. Bz-Ala-Ser-OH vegyülctekhez és amidjaikhoz. Az áramlási sebesség 3 ml/perc volt, az oszlop hőmérséklete 47 °C és a hullámhossz 260 nm. A kitermeléseket a reagensek — amelyeket az eluációs profil csúcsai alatti részekből gyűjtöttünk — moláris aránya alapján határoztuk meg. A termék meghatározása A foltokat vékonyréteg-kromatográfia módszerével, megfelelő standard vegyületek alkalmazásával azonosítottuk. Több terméket a nagynyomású folyadék-kromatográfia (HPLC) és aminosav-analízis módszerének kombinálásával határoztuk meg. E célból 10 perc után a reakcióclegyből 1 ml mennyiséget vettünk ki és a reakciót 250 n.1 6 mólos HC1 hozzáadásával leállítottuk. A pH-t NaOH-val 4-re állítottuk és az elegyet HPLC-vel elkülönítettük. (Waters-készülék két pumpával. Model 660 Solvent Programmer, Model U6K Injector, Model 450 Variable Wavelength Detector és Radiometer REC 61 vagy Hewlett Packard Recorder/Intcgrator Model 3380. Az cluációt 255 és 280 nm közötti, megfelelő hullámhosszon követtük. A fordított fázisú kromatográfiánál Waters C-18 /r-Bondapak oszlopot használtunk, metanolban 20 tf% TEAP (trimetil-ammónium-foszfát-puffer) eluáló rendszer alkalmazása mellett és az áramlási sebesség 1,5-2,0 ml/perc volt. A TEAP-puffert Rivier módszere [Use of trialkyl ammonium phosphate (TAAP) buffers in reverse phase HPLC for high resolution and high rccorvcry of peptides and proteins. J. Liq. Chrom. 1. 343—366, 1978] alapján állítottuk elő. Sok esetben a 0.1 mólos ecetsav (pH = 3), 20 % 0,1 mólos ecetsav (pH = 3) metanolban rendszer kielégítő elválasztást atloíl. Az elfolyó részt - amely N-acildipeptidet tartalmaz — manuálisan gyűjtöttük és Iiofileztiik vagy Büchi Rotovap készüléken 35-45 °C között szárazra pároltuk. A maradékból kis mintát 6 mólos HCI-bcn, 1 10 °C-on vákuumban, 36 órán át hidrolizállunk. Az cvaporált hiürolizátumot ezután Durrum D-500-as aminosav-analizátorral meghatároztuk. Szintézis szabad aminosavakkal, mint amin-komponenssel 1. példa Valinra 0.6 mólos, KCI-re 0,1 mólos és EDTA-ra 1 mmólos oldatból 2 ml-t (pH = 9,8) 100 gil (0,1 mmól) 1 mólos Bz-Aia-OMe (melyet 96 % etanolban oldottunk) oldattal elegyítettük. A reakciót Radiometer pH-stat készülékben 35 °C-on és pH = 9,8-nél végeztük, mialatt a konstans pH-értékeí 0,5 mólos NaOH automatikus hozzáadásával biztosítottuk. A reakciót 0,7 mg karboxipeptidáz Y (150 egyseg/mg és De Forende Bryggericr módszere alapján készült) hozzáadásával indítottuk. 30 perc reakcióidő után a reakciót a pH-érték 6 mólos sósavval történő 1-re állításával megállítottuk.,A reakcióterméket tisztítottuk és nagynyomású kromatográfiáva! elválasztottuk. A Bz-Ala-Val-OH kitermelése 40 % voit. A termék 24 órán át és 6 mólos HCI-ben végzett hidrolízise után nyert mennyiségi aminosav-analízis eredménye 1,0 mól alanin és 1,0 mól valin. A pH hatását, hőmérsékletet, szubszírát-komponens, amh-komponens és C'PD-Y koncentrációját kitermelésre Rz-Ala-OMe + H-Val-OH SÜLI Bz-Ala-Val-OH + + C'H3OH reakció függvényében, a fentiekben leírt módszer szerint végzett 5 kísérletben megvizsgáltuk. Valamennyi kísérletben a paraméterek egyikét az alábbiakban változtattuk, míg az összes többit konstans értéken tartottak: 0.6 mólos valin, 55 mmólos Bz-AIa-OMe, 4.5 mmólos CPD-Y. pH 9.7. 35 °C. Az eredményeket az S. ábra szemlélteti. Az la ábrából látható, hogy a kitermeléshez optimális pH-tártomány igen szűk és mindössze 0.5 pH egységre terjed. Az Ab ábra mutatja, hogy a reakcióhőmérséklet növekedése viszonylag kisebb hidiolízis miatt a szintézis lineáris növekedését okozza. Azonban a 45 °C feletti .hőmérsékleten megfigyelhető cnzlm-inaktiválódás és ncm-cnz.imatikus észter-hidrolízis mái gátolja a kívánt reakciót. Alacsonyabb hőmérsékleti értékeken, egészen pH 10-ig az észter hidrolízise elhanyagolható a 10 perces standard reakcióidőn belül. Ez akkor válik fontossá, ha az enzimatikus reakció gátolva van és 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
