186278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inaktivált chlamydia vakcina előállítására
3 186278 4 A találmány tárgya eljárás Chlamydia okozta kórképek csökkentésére alkalmas inaktivált vakcina előállítására. A Chlamydia igen széles körben elterjedt, széles gazdaspektrummal rendelkező mikroorganizmus. Megtalálható a legkülönfélébb madárfajokban, további házi és vadonélő emlősökben. A fertőzöttség gyakran nem jár klinikai tünetekkel, de kialakulhat szeptikémia vagy csupán egy-egy szervrendszerre korlátozódó betegség is. Chlamydiák emlősállatokban (elsősorban juhok, szarvasmarhák és sertés) a következő kórformákat idézik elő: vetélés, tüdőgyulladás, ízületi gyulladás, kötőhártyagyulladás, szórványosan agy- és gerincvelőgyulladás és tőgygyulladás. A Chlamydiák által előidézett kórformák egymagukban is tetemes gazdasági kárt képesek előidézni. Ennél jóval nagyobb gazdasági kárt okoznak a más kórokozókkal együtt kialakult szövődményes kórformáik, amelyek sok esetben elfedik és nehezen felismerhetővé teszik az alapbántalmat. A fertőzés veszélyének kitett vagy fertőzött, de klinikai tüneteket nem mutató állományok specifikus védelméről aktív immunizálással kell gondoskodni. A védekezés legcélszerűbben inaktivált vakcina felhasználásával oldható meg. Napjainkban immunizálásra leginkább tojás szikzsákjában elszaporított Chlamydiát használnak fel. A tojásból nyert sziktömlőt homogenizálják (turmixolják), és a mikroorganizmust formalinnal inaktiválják, majd az antigéneket timsóval kicsapják. A timsó azonban nemcsak az antigéneket, hanem a tojásból származó fehérjék egy részét is kicsapja. A csapadékot centrifugálással még tömörítik, majd 1 : 10 arányban paraffinolajjal keverik össze. Ezzel a módszerrel a vakcina előállítása rendkívül munkaigényes, az antigén-tartalom az ülepedés és a vakcina nagy viszkozitása miatt nehezen applikálható. Káros az is, hogy a védendő állat immunrendszerét a vakcinában lévő fajidegen fehérjék megterhelik. A 4 328 208 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szerint tojáson vagy sejttenyészetben elszaporitott chlamydiát merthiolát és formaldehid együttes alkalmazásával inaktiválnak. Adjuválás céljából akrilamidot adnak az antigén-oldathoz, és termosztátban polimerizálják. A kapott gélszerű polimert injekcióhoz alkalmas oldatban (fiziológiás sóoldat, Hanks oldat) újból szuszpendálják. Az említett eljárásban adjuvánsként használt poliakrilamid-gél a nem szolubilis antigének esetén kevéssé alkalmas, mert a kialakított térhálós gélszerkezet az antigént magába zárja, ami a szervezet immúnkompetens sejtjeinek hozzájutását nehezíti. Hátrányos továbbá, hogy az akrilamid a szervezet számára neurotoxikus anyag, a polimerizáció során pedig nehéz a reakciót úgy szabályozni, hogy ne maradjon monomer a készítményben. Más publikáció (Bull. Acad. Vét. de France 1978, 51, 81—86) chlamydia tartalmú belélegezhető készítményt ismertet. Az inaktiválást freonnal végzik ; a freonos inaktiválás hatékonysága nem mindig kielégítő. Ugyanakkor jelentős mértékben károsítja a felületi fehérjéket. Adjuvánsként kálcium-foszfátgélt alkalmaznak, és — a leírás alapján — a gél mindig ugyanazon szerkezeti jelleggel való kialakítása nehéz. A találmány feladata olyan eljárás kidolgozása, amellyel a chlamydiózis ellen védettséget nyújtó inaktivált vakcina állítható elő egyszerű és ipari termelésre alkalmas módon. A fenti feladatot olyan eljárással oldottuk meg, amelynek során 6—9 napig, előnyösen 7 napig előkeltetett tyúktojásokat a Chamydia psittaci OKI 00253 szám alatt letétbe helyezett törzzsel beoltunk, a tojásokat inkubáljuk, a 8. és 12. nap között elpusztult embriót tartalmazó tojások szikhártyáját összegyűjtjük, homogenizáljuk, a szuszpenzió pH-értékét 5,8 és 7,8 közötti, előnyösen 7,2 értékre állítjuk be, a mikroorganizmust előnyösen formalinnal, /íí-propio-Iaktonnal vagy etilén-iminnel inaktiváljuk és a nyert folyadékot depót hatású anyaggal, előnyösen ásványi olajjal, Al(OH)3- vagy AlP04-géllel összekeverjük. A találmány szerinti eljárással olyan Chlamydia szuszpenzió állítható elő, amely nagy koncentrációban tartalmazza a Chlamydia antigént, és az állati szervezet immúnrendszerét faj idegen fehérjékkel fölöslegesen nem terheli meg. Az antigén feltárásának itt leírt módszere tette lehetővé, hogy jó hatékonyságú vakcinát állíthatunk elő. A vakcina gyártása nagymértékben gépesíthető. A kapott vakcinát a bevezetőben leírt kórképek megelőzésére, illetve a már kialakult tünetek csökkentésére, elsősorban a juhok és szarvasmarhák chlamydia okozta vetéléseinek csökkentésére használjuk fel. A találmányt az alábbi példákkal közelebbről ismertetjük. 1. példa A Chlamydia antigén termeléséhez 7 napig előkeltetett, embrionált tyúktojásokat használunk. A tojások sziküregébe oltással 0,2 ml megfelelő titerű (107E1D50) Chlamydia szuszpenziót juttatunk. A szaporodó mikroorganizmus hatására az embriók a 8. és 12. nap között elpusztulnak. A tojások tompa felén, a légkamrák magasságában a tojáshéjat izzó drótkrikával körbeégetjük. A héj eltávolítása után a felnyitott tojásokból a szikzsákot kivesszük. Az összegyűjtött sziózsákokat steril dróthálós tölcsérbe helyezzük, hogy a hígan folyó szikanyag átcsurogjon. A szikhártyák súlyát megmérjük, utána az anyagot turmixban 5-szőrös mennyiségű .Tensen-puffer hozzáadása után homogenizáljuk (50 g NaCl, 86,39 g Na2HP04.2H20, 26,0 g KH2P04 10 liter vízre ; pH 7,2—7,4). A homogenizátumot 4—8 °C-on 3000 g-vel 30 percen át centrifugáljuk. A felülúszó részt összegyűjtjük. Az üledéket Jensen-pufferrel az eredeti térfogatra feltöltjük, majd újból homogenizáljuk és centrifugáljuk. Az egyesített két centrifugátum képezi a vakcina alapanyagát, útere legalább 106 EID50/ml. A Chlamydia szuszpenziót 400 ^g/ml mennyiségű nátrium-aziddal konzerváljuk, majd 600 /ig/ml formaldehiddel inaktiváljuk, szobahőmérsékleten (22—25 °C- on) 5 napon keresztül, majd 4—8 °C-on tároljuk tovább. Az inaktiválás eredményességét tojásoltással ellenőrizzük. A bakterológiai fertőzöttséget a VI. Magyar Gyógyszerkönyv előírásai szerint vizsgáljuk. Az inaktivált és steril antigént azonos mennyiségű inkomplett olajos adjuvánssal összekeverjük és homogenizáljuk. A kapott vakcina 4—8 °C-on 1 évig tárolható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
