186088. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán alfa-1-fetoprotein tisztítására
I i 86 088 2 A találmány tárgya új eljárás humán alfa-1- foetoprotein (AFP) tisztítására. A humán AFP-t különböző diagnosztikai eljárásokban, pl. prenatális és tumor diagnosztikában használják. Felhasználáskor fontos, hogy az AFP igen tiszta legyen. Az analitikai tisztaságú humán AFP-t jelenleg soklépéses tisztítási eljárásokkal, úgymint sóval történő kicsapás; gélszűrés; ioncserés kromatográfia; hagyományos, poliklonális ellenanyagot alkalmazó immunszorbens technika kombinációjával állítják elő (J. T. Wu és munkatársai Biochem. Med. 24, 210 [1980]; Baig, M. M. Anal. Biochem. 101, 200 [1980]). Ezeknek az eljárásoknak hátránya, hogy a tisztítás hosszú ideig tart, nagy munka- és anyagráfordítást igényel, továbbá - mint a soklépéses eljárásoknál általában - nagy az anyagveszteség. A találmány célja a fenti hátrányok kiküszöbölése mellett olyan eljárás kidolgozása, amely egyszerű módon teszi lehetővé nagy tisztaságú humán AFP előállítását. A találmány alapja az a felismerés, hogy a humán AFP affinitáskromatográfiával monoklonális ellenanyag felhasználásával egyetlen lépésben megtisztítható. A fentiek alapján a találmány tárgya eljárás humán AFP tisztítására. A találmány értelmében az AFP-tartalmú biológiai folyadékból az AFP-t anti AFP felhasználásával készített immunszorbens kromatográfiás oszlopon megkötjük, majd 3-nál alacsonyabb pH-jú puffernd vagy nagy ionerősségű oldattal eluáljuk. A találmány szerinti eljárást előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy hibridoma technikával monoklonális anti AFP ellenanyagot állítunk elő. Alkalmas módszereket ismertetnek pi. G. Köhler and C. Milstein: Nature 256, 495-497 (1975); R. Kennett: Cell fusion, Methods in Enzymology (W. Jakoby and J. Pastan eds.) Academic Press, New York, 345-349 (1979); T. J. Mckearn: Monoclonal antibodies, Hybridomas: A new dimension in biological analyses (R. H. Kennett, T. J. Mckearn and K. B. Bechtol) Plenum Press, New York, London (1980). A hibridómák felülúszójából vagy a hibridsejtekkel intraperitoneálisan beoltott kísérleti állatok (pl. egerek) szérumából vagy hasüri folyadékából izoláljuk az anti AFP-t vagy annak immunglobulinfrakcióját. Az immunglobulin-frakciót pl. ammónium-szuifátos kicsapással vagy ioncserés kromatográfiával nyerhetjük ki. A tisztított anti AFP-t szilárd fázisú hordozón rögzítjük. Erre a célra ciánbromíddal aktivált Sepharose 4B-t vagy AH-Sepharose 4B-t alkalmazhatunk. A fenti módon elkészített immunszorbenst kromatográfiás oszlopon egyszer átengedjük vagy elő. nyösen az oszlop telítéséig cirkuláltatjuk a magas AFP-tartalmú biológiai folyadékot, pl. magzatvizet, köldökvért vagy kóros (Primer májkarcioma) szérumot, melyből az AFP specifikusan megkötődik. Ezután a fehérjementesre mosott oszlopról eluáljuk a specifikusan kötött frakciót. Az eluálás; 3,0-nái alacsonyabb pH-jú pufferral, pl. 2,4 pH-ju glicin-glükóz-pufferral vagy nagy ionerősségü oldattal, pl. 1-5 mólos ammonium-, kálium- vagy nátrium-tiocianát-oldattal végezhetjük. Az AFP- tartahnú frakciókat fehérjetartalom-méréssel azonosítjuk, egyesítjük, majd az oldat pH-ját szilárd TRIS-sei 7-8 pH-ra állítjuk be. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy az AFP tisztítása egyetlen lépésben megoldható, az immunszorbens technika alkalmazása mellett más tisztítási módszerek kombinálására nincs szükség. Az imnunszorbens oszlop elkészítéséhez szükséges monoklonális ellenanyag a megfelelő hibridóma sejt’ onal kiválasztásával igen szigorú specifitással biztosítható, szemben a hagyományos, poliklonális ellenanyag-termeléssel, ahol a képződött immunszérumok minősége minden immunizált állat esetében más és más, és a poliklonális immunszérumot számos kimerítéses és tisztítási lépésen kell keresztülvinni a megfelelő specifitás eléréséhez. A hibridoma sejtek fenntartásával az ellenanyag-termelés bármikor biztonsággal megismételhető. A találmány szerinti eljárás előnye továbbá, hogy a kapott termék legalább 95%-os tisztaságú, a tisztítás kitermelése magas, 80-85%. A találmány szerinti eljárást az alábbi példával szemléltetjük: Példa Monoklonális anti AFP ellenanyagot állítunk elő Köhler és Milstein módszerével. Az ellenanyagtermelő sejtekkel intraperitoneálisan beoltott egerek anti AFP-t tartalmazó hasűri folyadékának immunglobulin-frakcióját ammónium-szulfátos kicsapással nyerjük ki. A kapott csapadékot PBS-ben (foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldat) feloldjuk, és egy éjszakán át + 4 °C-on PBS-sel szemben dializáljuk. Az oldat fehérjekoncentrációja 280 nm hullámhosszon; l OD^^-OjőS mg/ml. Cíán-bromiddal aktivált Sepharose 4B-Í (Pharmacia gyártmány) 1 mmólos sósavban duzzasztunk 15 percig, majd ! mmólos sósavval mossuk. Ezután a gélt 0,1 mólos, 8,8 pH-jú nátrium-karbonátpufferral mossuk, és összekeverjük a kötőpufferban feloldott 10 mg fehérjével. Kötőpuíferként 8,8 pH- jú 0,1 mólos nátrium-karbonát-puffert használunk. A szuszpenziót 1 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten forgatás közben. A gélt ezután oszlopba töltjük, és mossuk sorban a következő oldatokkal: kötőpuffer, 1 mólos etanol-amin pH = 8,0, 0,1 mólos nátrium-acetál-pufTer (pH = 4,4)+l mól nátrium-klorid, kötőpuffer + I mól nátrium-klorid, PBS. A mosáshoz tízszeres oszloptérfogatnak megfelelő mennyiségű mosóoldatokat használunk. Az így elkészített oszlop tízszer-hússzor használható. Az AFP-tartalmú biológiai folyadékot, pl. magzatvizet, köldökvért stb. háromszorosára hígítjuk PBS-sel, a fenti módon készített affinitás kromatográfiás oszlopot PBS-sel ekvilibráijuk, majd a hígított mintát egy éjszakán át +4 °C-on cirkuláltatjuk az oszlopon. Másnap PBS-sel fehérjementességig mossuk az oszlopot, majd a specifikusan kötődött frakciót 2,4 pH-jú 0,35 mól gíicín - 0,1 mól glükóz pufferral eluáljuk. Az AFP-tartalmú frakciókat fehérjetartalom-méréssel azonosítjuk, egyesítjük, és a pH-t szilárd TRIS-sel 7 és 8 közöttire 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
