185928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás 4-helyettesített 1-béta-D-ribofuranozil-1H-imidazo-[4,5-c] piridinek előállítására
1 2 185 928 sével végezzük. A klórt védett aminocsoportra, például benzilamino- vagy benzhidril-amino-csoportra is cserélhetjük, és a védőcsóportot ismert módon, például az előzőekben leírtak szerint távohtjuk el. 5 A találmány szerint olyan módon is eljárhatunk, hogy az (I) általános képletű vegyületet, amelynek képletében R = halogén vagy védett aminocsoport, enzimatikus úton ribozilezzük a fentiekben ismertetett módon, majd a 4-szubsztituenst aminocso- 10 porttá alakítjuk, s így 4-amino-l-ß-D-ribofuranozíl-1 H-ímidazo(4,5-c)piridint kapunk. Jóllehet a fenti ribozilezéshez szükséges ribóz-1- foszfát az irodalomban ismertetett szintetikus úton is előállítható (Wright, R. S. és Khorana, H. G. J. 15 Am. Chem. Soc. 78,811 (1956)), kényelmi és célszerűségi okokból ribozil-donorból és szervetlen foszfát vegyületből in situ is előállíthatjuk. A reakciókat egymástól elkülönítetten is végezhetjük, azaz az enzimatikus vagy kémiai úton előállított ribóz- 20 1-foszfátot elkülönítjük és ezt használjuk kiindulási anyagként, előnyösen azonban a két reakciót összevonjuk („one pot process”) és a ribóz-1-foszfát intermediert in situ kapjuk. így az összevont reakcióban a donor ribonukleozid ribozil-egységét 25 építjük rá a 3-deazapurin bázisra, és így a kívánt ribonukleozidot kapjuk. Ribozil-donorként purin-ribonukleozidot, így például adenozint, pirimidin-ribonukleozidot, így például uracil-ribonukleozidot, vagy többféle ribo- 30 nukleozid és nem-nukleozid természetű anyag keverékét, előnyösen nem-nukleozid természetű anyagtól mentes ribozil-donort, különösen előnyösen pirimidin-ribonukleozidot használunk. Donorként pirimidin-ribonukleozid használata 35 két okból is előnyös, egyrészt, mivel a donor ribonukleozid tulajdonságai eléggé különbözőek a kívánt terméktől, könnyű tisztítást tesz lehetővé, másrészt a reakcióban felszabaduló donor bázis pirimidin, nem pedig purin, ezért a donor és akcep- 40 torbázis között az enzim (purin nukleozid foszforiláz) aktív centrumához történő versengés kisebb. A pirimidin- és purin-ribonukleozid donorokat bármelyik ismert módszerrel előállíthatjuk (például Hotchiss, R. D. által ismertetettel - J. Biol. Chem. 45 175, 315 (1948)). A fentiekben ismertetett mindkét reakciót számos különböző mikroorganizmusban és emlős szövetben jelenlévő enzimek katalizálják. A donor ribonuklçozid foszforilezését például purin-nukleo- 50 zid-foszforiláz katalizálja, ha a donor purin-ribonukleozid, vagy pirimidin-nukleozid-foszforiláz, timidin foszforiláz vagy uridin foszforiláz katalizálja, amennyiben donorként pirimidin-ribonukleozidot használunk. A második reakciót - melyben 55 3-deazapurinból és ribóz-1-foszfátból a kivánt 3- deazapurin-ribonukleozidot állítjuk elő - purinnukleozid-foszforiláz katalizálja. Ily módon ribozilcsoportot átvivő enzimrendszerként vagy csak az utóbbi foszforilázt önmagá- 60 ban, vagy - ha a ribozil donor pirimidin- vagy pirimidin-származék-ribonukleozid - bármelyik előbbi típussal kombinálva használjuk. Amint a fentiekben már említettük, a találmány szerinti eljárásban katalizátorként használt enzi- g5 mek különféle mikroorganizmusokban és emlős szövetekben fordulnak elő. Enzimforrásként azonban aerob baktériumokat, például B. stearothermophilus-t, előnyösen az amerikai kultúra gyűjteményben ATCC 11 303 számon deponált E-coli B-t használjuk. Az enzimeket tartalmazó baktériumok különböző körülmények között tenyészthetők, de előnytelen nagyobb mennyiségű glükózt tartalmazó táptalaj használata, mivel a baktérium sejtekben glükóz jelenlétében a nukleozid-foszforiláz enzimek szintje csökken. Tapasztalatunk szerint a nyers enzimpreparátumok kevésbé alkalmasak, mint a tisztított készítmények, annak következtében, hogy az előzőek zavaró nukleinsavakat és a szükséges enzimeken kívül egyéb enzimeket is tartalmaznak. A szennyező enzimek a szubsztrátok és termékek nem kívánt változásait katalizálják, sőt a szükséges enzimek proteolízisét is okozhatják. E tényezők nemcsak a kívánt termékek hozamát csökkentik, hanem megnehezítik a reakcióelegyből történő elkülönítésüket is. Fentiek alapján célszerűen a nyers enzimpreparátumot mielőtt a reakcióelegyhez hozzáadjuk, ismert módon tisztítjuk. így például a kívánt enzimeket a sejt-extraktumokból kálcium-foszfát géllel és ioncseíe-kromatográfiával különíthetjük el vagy töményíthetjük be. A sejt-extraktumot a kálciumfoszfát géllel való kezelést megelőzően streptomicinnel vagy nukleázzal (DNS-áz + RNS-áz), az ioncsere-kromatográfiát megelőzően nukleázzal (DNS-áz + RNS-áz) is kezelhetjük. A nukleázzal való kezelést előnyösen 4 és 40 °C közötti hőmérsékletű, különösen előnyösen 25 °C hőmérsékletű dializálási körülmények között végezzük. A gélfiltrációt különösen előnyösen a tisztítás késői vagy végső szakaszában - amikor már csak kevés folyadék van jelen - alkalmazzuk. Az enzimeket megfelelően aktív állapotban és koncentrációban a fenti reakciók katalízisére használhatjuk. Általában a reakcióelegy ribozil-donort, 3-deazapurin bázist, szervetlen foszfátot, például dikálium-hidrogén-foszfátot (K2HP04-et) és megfelelő enzimet vagy enzimeket tartalmaz. Oldószerként vizet vagy legfeljebb 50%-nyi szerves oldószert, például metanolt, etanolt, propánok, butának, acetont, metil-etil-ketont, etil-acetátot, toluolt, tetrahidrofuránt, dioxánt, dimetil-szulfoxidot, triklór-metánt vagy celloszolvot használunk. Előnyösen 0,001-2000 mmól/l-es, különösen előnyösen 1-200 mmól/l-es koncentrációban végezzük a reakciót. A reakciót közel semleges pH értéken, azaz körülbelül pH = 5 és 9 között, előnyösen pH = 6,0-8,5 értéken, és 3 és 70 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A purin-nukleozid glikozidos kötése savas körülmények között, és különösen magasabb hőmérsékleten hasadhat, továbbá szélsőséges hőmérsékleti és pH viszonyok között az enzimek sem stabilisak. Az enzim koncentrációját előnyösen a használt ribozil donorok és akceptorok szubsztrát hatásfokától, valamint a reakcióidőtől függően választjuk meg. Bizonyos esetekben előnyös, ha az enzimből nagyobb mennyiséget használunk abból a célból, 3
