185715. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergokrisztin parazita úton való előállítására
1 185715 2 À találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként ergokriszlin parazita úton való előállítására, Claviceps purpurea törzs új variánsával. Az anyarozs alkaloidok előállításának két eltérő módja ismeretes; a termesztett drog extrakcióján alapuló eljárások, illetve a steril fermentációs alkaloidtermelés Claviceps törzsekkel. A steril fermentációs alkaloidtermelésre ismeretesek realizált eljárások (150631, 151724, 152239, 164816 lajstromszámú magyar szabadalmi leírások), ennek ellenére a drogtermesztés nem vesztette el jelentőségét s a világ peptidalkaloid termelésének jelentős hányada mindinkább a különböző alkaloidféleségekre dúsított drogot használja fel. Különösen érvényes ez az ergotamin és az ergokrisztin termelését illetően. Az ergolénvázas alkaloidokat termelő Claviceps purpurea törzs előállítása több korábbi szabadalomnak is tárgya, amelyekben változó módszerekkel igyekeztek magasabb hozamú törzsekhez jutni, így a 232648 számú szovjet szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, amelyben az ergotoxin előállítás céljára spóramérettel és lelepmorfológiával jellemezhető Claviceps purpurea törzset állítottak elő. A 154035 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás eljárása szerint speciális táptalajon, a telep szine alapján lehet ergotoxin termelésre képes törzseket előállítani. A 176003 iajstromszámú magyar szabadalmi leírás eljárást ismertet ergokrisztint termelő, rozsra virulens Claviceps purpurea törzs spóratenyészetének előállítására. A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az ergokrisztin parazita úton való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa- mesterséges táptalajokon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik,- spórái jól tartósíthatok,- spórái életképesek és virulensek, újra tápközegbe juttatva 90—95 %-ban kicsíráznak és a rozsra juttatva azt fertőzik,- magas droghozamot biztosít,- a drog főalkaloidként 99,5 %-ban ergokrisztint tartalmaz, és a főalkaloidokon kívül csak jelentéktelen szennyezést. A találmány célkitűzése magasabb ergokrisztin tartalmú törzsvariáns előállítása. Az új variáns előállátását az ivaros és szelekciós nemesítési mód alkalmazásával végeztük. Kiindulási anyag a 176003 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban szereplő, OKI-nál 00163 szám alatt 1977. május 2-án deponált, főleg ergokrisztint termelő törzs droganyaga. A drogból küllemileg megfelelő, simafelületű, nagyméretű szkleróciumokat választottunk ki. Ezeket nedves homokba ágyaztuk és 6 hétig 0-5’C-on tartottuk, majd a felületet steril vízzel lemosva Petri-csészében nedvesen tartott steril szivacsba helyeztük. A sztrómák kialakulása és kifejlődése után kiválasztottuk a legfejlettebbeket, amelynek felületén a peritéciumok kitüremkedései mikroszkópi vizsgálat alapján a legnagyobbak voltak. Ezeket 10%-os maláta-agar táptalaj fölött, steril körülmények között, hőráhatással aszkospórák kilövellésére késztettük. A kilövellt aszkospórákból kialakult telepeket a telep fejlődési üteme, spóratermelő képessége, morfológiája alapján szelektáltuk és izoláltuk. Az izolált telepek spóráit szubmersz tenyészetben felszaporítottuk és izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével. Az izolációt 20 m2-es rozssáv biztosította. A'kifejlődött szkleróciumokat vékonyrétegkromatográfiás analitikai vizsgálatok alapján szelektáltuk, az ergokrisztin tartalom és a mellékalkaloid szennyezés alapján. A legmagasabb ergokrisztin tartalmú, mellékalkaloid szennyezéstől mentes szkleróciumokból vegetatív szaporítással, steril szkleróciummetszetek maláta-agar táptalajra való oltásával felületi tenyészeteket készítettünk. Ezekből a felületi tenyészetekből a konídiumokat a példában leírt folyékony táptalajba oltva felszaporítottuk. A legtöbb konídiumot termelő tenyészeteket választottuk ki az életképesség figyelembevételével. A kiválasztott tenyészetek spóráit izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótűs fertőzésével, ahol a droghozam és a drog minőségi jellemzői szerint szelektáltuk. A szelekciós nemesítési munkát további 2 éven át folytattuk. Az új törzsvariánst, melynek intézeti jelzése Bkl/ 1/1/1980, 1982. május 27-én az Országos Közegészségügyi Intézetben a 00233 szám alatt deponáltuk. Az új törzsvariáns a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentációban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: Új törzsvariáns Régi törzs Intézeti jelzése Bkl/i/I/1980 Bkl/i OKI deponálási száma 00233 00163 OKI deponálási ideje 1982. május 27. 1977. május 2. Fcrmenlló spóraszáma (spóra/mm3) 5-6x 105 4-5* I05 Tartósított oltóspóra csírakcpcsscgc% 95-99 95-99 Virulcncia % 80-90 70-80 Ezcrszkleróciumtömcg (g) 185-205 175-200 Terméseredmény (kg/ha) 250-350 200-350 Ergokrisztin tartalom (mg/ g) 8-9,6 5-6,2 Ergokrisztin hozam (g/ha) (állag kg/ha * átlag mg/g) 2440 1540 Mcllckalkaloidok, szennyezések (az ossz. alkaloid tart. %-ában) 0,1 0,3 Zsírolajtartalom % 15-20 15-20 Az új törzsvariánsnál egyes esetekben 10,5 — 10,7 mg/g ergokrisztin értékeket is mértünk. A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik: 1. példa Az OKI-nál 00233 szám alatt deponált törzs 21 napos maláta-agar tenyészetével 500 ml-es Erlen-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
