185700. lajstromszámú szabadalom • Eljárás anyarozs alkaloidok, főként alfa-ergokriptin parazita úton való előállítására
1 185 700 2 A találmány tárgya eljárás anyarozs alkaloidok, főként alfa-ergokriptin parazita úton való előállítására, Claviceps purpurea törzs új variánsával. A korábbiakban az ergokriptint és ergokornint kizárólag szaprofita úton állították elő folyadék- 5 kultúrában, speciális táptalajon a szükséges feltételek biztosítása mellett végezték (164 816. lajstromszámú magyar szabadalmi leírás és a T/20 619 teljes vizsgálati közzététel). Parazita körülmények között, főleg alfa-ergo- 10 kriptint termelő Claviceps purpurea törzs eddig nem létezett. Ismeretes volt, olyan parazita anyarozs törzs, melynek spóráival fertőzött rozson képződött szklerócium alfa- és béta-ergokriptint, ergokomint és ergozint együttesen termel, amelynek 15 intézeti jelzése BkVe/169(12). A találmány célkitűzése olyan eljárás kidolgozása az alfa-ergokriptin parazita úton való előállítására, amelyben a parazita Claviceps purpurea törzs új variánsa 20- mesterséges táptalajon, agar felületen és süllyesztett tenyészetben jól spórázik,- spórái jól tartósíthatok,- spórái életképesek és virulensek,- magas droghozamot biztosít, 25- a drog főalkaloidként 90-95%-ban alfaergokriptint tartalmaz. Az új törzs előállítását a mutációt előidéző sugárkezelés, valamint az ivaros és szelekciós nemesítési mód alkalmazásával végeztük. Az alfa-ergo- 30 kriptint tartalmazó vegyes alkaloid tartalmú törzset, amelynek intézeti jelzése BkVe/169(12) 1981. november 9-én az Országos Közegészségügyi Intézetben 00217 szám alatt deponáltuk. Az alfa-ergokriptint tartalmazó vegyes alkaloidtartalmú törzs 35 droganyagából küllemileg megfelelő, simafelületü, nagyméretű szkleróciumokat választottunk ki. Ezeket a szkleróciumokat 1200 - 1500 Gray dózisú rádioaktív gamma-sugárzásnak vetettük alá, amely sugárdózist 12-15 óra alatt folyamatosan juttat- 40 tűk a szkleróciumokhoz. A kezelt szkleróciumokból steril darabkákat oltottunk 10%-os maláta-agar táptalajra. A letális dózis körüli sugármennyiséget túlélt szkleróciumokból létesített tenyészeteket maláta-kivonatot, szaharózt és Stoll féle tápsókat tar- 45 talmazó táptalajra oltva, 6 napos tenyésztés után újabb 500 - 800 Gray dózissal sugárkezeltük. A kezelt spóratömeget maláta-agar felületre szélesztettük. Kiválasztottuk és izoláltuk az eltérő morfológiájú telepeket, felszaporítás után spóráikat izolál- 50 tan rozskalászra oltottuk. Minden kifejlődött szklerócium felét vékonyrétegkromatográfiás módszerrel analizáltuk. A több száz szklerócium vizsgálata során találtunk néhány mutáns egyedet, amely alfa-ergokriptint tartalmazott, lényegében 55 béta-ergokriptintől mentesen. Kísérő alkaloidként béta-ergokriptint és ergozint találtunk. A főleg alfa-ergokriptint tartalmazó szkleróciumokat az alkaloidszint javítása céljából ivaros nemesítési folyamatnak vetettük alá. 60 E célból a kiválasztott szkleróciumokat nedves homokba ágyaztuk és 6 hétig 0-5 °C-on tartottuk, majd a felületet steril vízzel lemosva Petri-csészében nedvesen tartott steril szivacsra helyeztük. A sztrómák kialakulása és kifejlődése után kiválasztottuk 65 a megfelelő méretű és fejlettségű sztrómákat, amelyeket hőráhatással az aszkospórák kilövellésére késztettünk. Az aszkospórákat 10 %-os malátaagar táptalajon steril körülmények között tenyésztettük. Az így kialakult telepek spóráit felszaporítva izolált parazita körülmények közé helyeztük, rozsnövények oltótüs fertőzésével. Az izolációt 20 m-es rozssáv biztosította. A kifejlődött szkleróciumokat a vékonyrétegkromatográfiás analitikai vizsgálatok alapján szelektáltuk. A szelekciós nemesítési munkát további 2 éven át folytattuk. Az új törzset, amelynek intézeti jelzése Bk5/208/ 1981, 1981. november 9-én az Országos Közegészségügyi Intézetben a 00219 szám alatt deponáltuk. Az új törzs a kiindulási tenyészethez képest a spórafermentációban és a drogtermesztésben az alábbi eredményeket adta: Új törzs Régi törzs Intézeti jelzése Bk5/208( 1981 ) BkVe/169(l2) OKI deponálási száma 00219 00217 OKI deponálási ideje 1981. noV. 9. 1981. nov. 9. Fcrmcntlé spóraszáma (spóra/mm3) 5-6- 105 1-2- 105 Tartósított oltóspóra csiraképcsségc % 95-98 80-90 Virulcncia % 90-95 60-65 lizcrszklcrócitimtömeg (g) 165 120 Terméseredmény (kg/ha) 300-350 100-150 Alfa-ergokriptin hozam (kg/ha) Î.463 0,063 Mcllékalkaloidok 5-10% béla-ergokriptin nyom ergozin ergokornin béta-ergokriptin ergozin Zsirolajtartalom % 19 22 A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példák szemléltetik: I. példa Az OKI-nál 00219 szám alatt deponált törzs 21 napos maláta agar tenyészetével 500 ml-es. Erlenmeyer lombikban a következő összetételű táptalajt oltottuk be: malátakivonat szaharóz borostyánkősav kálciumnitrát káliumdihidrogénfoszfát magnéziumszulfát káliumklorid vasszulfát cinkszulfát 2.0 g/g% 5.0 g/g% 1.0 g/g% 0,1 g/g% 0,025 g/g'% 0,025 g/g% 0,0125 g/g% 0,0008 g/g% 0,0003 g/g% 2
