185677. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből
185 677 2 6. példa Mindenben az 1. példa szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a második DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint 0,9 mól/ 1 KC1 + 16 mmól/1 imidazol-HCl pH 6,5-ös oldattal eluáljuk. A terméket 29%-os hozammal kapjuk. Tisztasága megegyezik az 1. példában megadottal. 7. példa Mindenben az I. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy a kalmodulin utótisztítását Sephadex G-100 oszlopon történő gélszürés helyett ammónium-szulfátos precipitálással végezzük. A második DEAE Sephadex batch-adszorpciót követően a kalmodulint tartalmazó fehérje frakciót 0,1 n NaOH oldattal 7,0 pH értékre állítjuk, majd 50% telítésig telített ammónium-szulfát oldatot adunk hozzá. A kicsapódott fehérjéket 30 percig 10 000 x g-n történő centrifugálással eltávolítjuk. A csapadékot eldobjuk, majd a felülúszót pH 4,0-re állítjuk 50% ammónium-szulfátot tartalmazó 0,5 mól/1 H2SÓ4 oldattal. Az oldatot 1 óráig jégfürdőn állni hagyjuk, majd 30 percig 10 000 x g-n történő centrifugálással kiülepítjük a kalmodulin-tartalmú csapadékot. Az így nyert tiszta kalmodulint dialízissel vagy Sephadex G-25 oszlopon történő gélszüréssel szulfátmentesítjük, majd a terméket lioíilizáljuk. A kapott termék hozama és tisztasága mindenben megegyezik az 1. példában megadottal. 5 Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből, a vörösvérsejtek hemolizálása, a hemolizá-10 tűmből anioncserélő gyantával a kalmodulin kivonása, az anioncserélő gyantáról a kalrnodulinnak sóoldattal végzett első eluálása, az eluátum hőkezelése, a kicsapódott fehérjék elkülönítése, a kalmodulinnak anioncserélő gyantával végzett másodszo-15 ri kivonása, majd sóoldattal végzett másodszori eluálása és adott esetben utótisztítása útján, azzal jellemezve, hogy az első eluálás utáni hőkezelést 80 °C és 100°C közötti, előnyösen 85 — 90 °C hőmérsékleten 3-15 percen át, előnyösen 5-10 per-20 cen át végezzük, és a másodszori kivonást 0,5 mól/1 és 0,95 mól/1 közötti, előnyösen 0,6-0,7 mól/1 töménységű vizes alkálifémsó-oldattal végezzük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kalmodulin mádo-25 szőri eluálását alkálifém-kloridot tartalmazó vizes oldattal végezzük. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kalmodulin másodszori eluálását vizes kálium-klorid oldattal végez-30 zük. Ábra nélkül Kiadja az Országos Találmányi Hivatal A kiadásért felel: Hinter Zoltán osztályvezető Megjelent: a Műszaki Könyvkiadó gondozásában COPYLUX Nyomdaipari és Sokszorosító Kisszövetkezet
