185677. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből
1 Í85 CT7 2 A találmány tárgya eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből. Az utóbbi évek biokémiai kutatásának egyik fontos felismerése, hogy valamennyi élő sejtben a szabályozások központi molekulája egy 17 000 mólsúlyú, kalcium-kötő fehérje, amelyet 1979-ben calmodulin-nak (a továbbiakban: kalmodulin) neveztek el (Sarkadi B., Szász I. és Gárdos G.: Haematologia 14, 121 — 136 (1981); Gietzen, K.. és munkatársai, Proceedings of the International Vinca Alkaloid Symposium - Vindesine, Basel, 16-26. oldal, (1981); Cheung W. Y., Science 207, 19 — 27 (1980)). A kalmodulin nagy mennyiségben, olcsón és tisztított formában való előállítása jelentős mértékben előrevinné a sejten belüli szabályozások kutatását, gyógyszerként való alkalmazása új távlatokat nyitna a gyógyításban. Ismeretes, hogy a kalmodulin a különböző szövetekben változó - általában 50 — 250 mg/kg szövet - mennyiségben fordul elő. A tisztított kalmodulin előállítása igen sok lépésből álló, munka- és anyagigényes eljárás. Jelenleg két nyugati cég, a Fiuka és a Sigma hoz forgalomba tisztított kalmodulint magas áron. Mindkét gyártó cég marhaagyból állítja elő a kalmodulint olyan költséges eljárással, amelynek megvalósításához a szövet homogenizálása és az oldható fehérjék kinyerése szükséges (Jamieson G. A. és Vanaman T. C., Biochem. Biophys. Res. Commun. 90, 1048— 1056 (1979)). Ismeretesek irodalmi közlemények a kalmodulin vörösvérsejtekből történő előállítására is (Sarkadi B., Szász I. és Gárdos B., Biochim. Biophys. Acta 598, 326-338 (1980)), de ezekben az eljárásokban ultracentrifugáíással végzett membrán-mentesítés, többszörös gélkromatográfia, ultraszüréssel végzett koncentrálás, valamint egyéb költséges tisztítási eljárások, pl. gél elektroforézis szerepelnek (Muallem S. és Karlish S. J. D., FEBS Letters, 107, 209-212 (1979)). A gyógyszergyárak által forgalomba hozott kalmodulin magas ára jól jelzi az előállítás költségességét. A találmány célja az ismert megoldások hátrányainak kiküszöbölésével olyan eljárás biztosítása, amely a kalmodulinnak olcsó és nagy mennyiségben rendelkezésre álló nyersanyagból egyszerű és hatásos módon, tiszta formában való előállítását teszi lehetővé. A találmány alapja az a felismerés, hogy a kalmodulin egy lépésben, anioncserélő gyantás adszorpcióval kinyerhető vörösvérsejt hemolizátumából, és így lehetővé válik mindenfajta membránmentesítést célzó eljárás, például ultracentrifugálás elkerülése. A találmány további alapja az a felismerés, hogy az elkülönített kalmodulin hőkezeléssel és újabb ioncserélő gyantás kivonással jó hatásfokkal és nagy tisztaságban kinyerhető. Fentiek alapján a találmány tárgya eljárás kalmodulin előállítására vörösvérsejtekből, a vörösvérsejtek hemolizálása, a hemolizátumbó! anioncserélő gyantával a kalmodulin kivonása, az anioncserélő gyantáról a kalmodulinnak sóoldattal végzett első eluálása, az eluátum hőkezelése, a kicsapódott fehérjék elkülönítése, a kalmodulinnak anioncserélő gyantával végzett másodszori kivonása, majd sóoldattal végzett másodszori eluálása és adott esetben utótisztítása útján, A találmány szerinti eljárást úgy végezzük, hogy az első eluálás utáni hőkezelést 80 °C és 100 “C közötti, előnyösen 85-90 °C hőmérsékleten 3-15 percen át, előnyösen 5-10 percen át végezzük, és a másodszori eluálást 0,5 mól/1 és 0,95 mól/1 közötti, előnyösen 0,6-0,7 mól/1 töménységű vizes alkálifémsó-oldattal végezzük. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint a vörösvérsejteket hipotóniás oldattal, célszerűen desztillált vízzel hemolizáljuk. A kalmodulin anioncserélő gyantás kivonását előnyösen batch-adszorpcióval végezzük, ami annyit jelent, hogy a vörösvérsejt hemolizátumhoz keverjük az előre duzzasztott, pufferrel ekvilíbrált és kilevegőztetett anioncserélö gyantát. A kalmodulin néhány perces kevergetés után adszorbeálódik a gyantához. A kalmodulint az anioncserélő gyantáról célszerűen alkálifém-kloridot tartalmazó vizes oldattal, előnyösen vizes kálium-klorid oldattal eluáljuk. Az eluátumot célszerűen 70 °C és 100 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 80-90°C hőmérsékleten hőkezeljük. A hőkezeléssel kicsapott fehérjéket előnyösen centrifugálással különítjük el. A kalmodulin utótisztítását és sómentesítését célszerűen gélszűréssel végezzük. Amennyiben a találmány szerinti eljárással előállított kalmodulint nem azonnal használjuk fel, célszerű mélyhűtve, ill. fagyasztva-szárítva tárolni. A találmány értelmében célszerűen úgy járunk el, hogy emlős állatok vörösvérsejtjeit fiziológiás sóoldattal mossuk, majd a vörösvérsejt fiziológiás sóoldattal mossuk, majd a vörösvérsejt koncentrátumot desztillált vízzel hemolizáljuk. A hemolizátumból dietil-amino-etil- (DEAE) Sephadex vagy DEAE cellulóz anioncserélő gyantával, batchadszorpcióval vonjuk ki a kalmodulint, majd a gyantáról 0,64 mól/1 KC1 oldattal eiuáljuk. Az eluátumot 85 °C-on 3 percig hőkezeljük, majd a kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítjuk. A második kalmodulin kivonást is anioncserélő (DEAE Sephadex vagy DEAE cellulóz) gyantával, batch-adszorpcióval végezzük, majd a gyantát oszlopba töltjük. A kalmodulint ismét 0,64 mól/1 KC1 oldattal eluáljuk. A töményen eluált kalmodulint Sephadex gélszűréssel sómentesítjük és utótisztítjuk. A tisztított kalmodulint mélyhűtve tároljuk vagy fagyasztva-szárítjuk. A találmány szerinti eljárás főbb előnyei a következők: a) Az emlős állatok szervezetében előforduló kalmodulin kémiailag egységes anyag; ezért mind vérpótlásra már fel nem használható készítményekből, mind vágóhídi állatok véréből ki lehet nyerni. Ez annyit jelent, hogy a vérellátó szolgálatban hulladékba kerülő vörösvérsejt-koncentrátum a találmány szerinti eljárással felhasználható kalmodulin előállítására. Ugyancsak felhasználható erre a célra a még nagyobb mennyiségben rendelkezésre álló és nagyrészt hulladékba kerülő vágóhídi vér. b) Feleslegessé teszi az eddig ismert módszerek esetén szükséges szövethomogenizálást, az oldható fehérjék kivonását, valamint az igen nagyszámú egyéb fehérjefrakcióktól való költséges és munka5 0 !5 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
