185603. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rosszindulatú daganatos sejtek kimutatására
1 185 603 2 amelyek mentén normális állapotban az idegsejtek új helyzetükbe mozognak. Ha az idegsejtek nem képesek ezeken a gliaszálakon felmászni - „Reeler” betegség lép fel — amely az idegsejtekben vagy a gliában vagy mindkettőben fellépő zavarral magyarázható. Az 1. vagy 2. példában leírt módszerrel „Reeler” betegségben szenvedő egér agyából recognint állítunk elő és a normális egéragyból kapott recogninnal vetjük össze. A normális egéragy valamennyi területéről kapott recognin molekulasúlya 8000. A reeler recognin molekulasúlya 3600-5000. A reeler recognin abnormális, ezt tanúsítja a kisebb molekulasúly is. Ezen felül a „Reeler” betegségben szenvedő egér agyának kisagy részéből nyert recognin mennyisége is sokkal kisebb, mint a "normál agyból nyert recognin mennyiség. Az 1. táblázat a fenti eredményeket szemlélteti. 1. táblázat Recognin-koncentráció egéragyban mg/g Normális „Reeler* ’ Kisagy (16 napos egér) 2,50 0,71 Kéreg (16 napos egér) 0,60 0,96 Kéreg (4 napos egér) 0,29 0,53 Agytörzs (16 napos egér) 0,90 1,64 Egész agy ( 17 napos egér) 1,27 1,53 Egész agy (1 napos egér) 5,00 5,86 Az 1, táblázat azt mutatja, hogy míg a „Reeler” betegségben szenvedő egér kisagyában a recognin koncentráció jelentősen csökkent, az agy más területein azonos vagy nagyobb recognin-koncentrációval találkozunk. A recognin nem vándorolhat az agy más területeiről a kisagyba, vagyis a „Reeler” agy más területein fellépő kisebb koncentráció növekedés bizonyos kompenzáló hatást tükrözhet vissza. A „Reeler” agyban ezt a patologikus recognint összevetjük az agysejteknek azzal a tulajdonságával, mely szerint nem képesek vándorolni a megfelelő elhelyezkedés eléréséhez szükséges kapcsolatok kialakításához, ezáltal bebizonyosodik a recogninok szerepe a sejteken belül, a felismerésben és a tanulásban. A „Reeler” betegségben szenvedő egér agyából előállított recogninok antirecogninjei is előállíthatok, és ezek az antirecogninok hasonlóan alkalmazhatók egérnél, mint az anti-astrocytin és anti-malignin. Az eljárást később írjuk le. 3. példa Malignin-prekurzor előállítása mesterséges ráksejttenyészet fermentálások során: Legfőképpen gondosan ügyelünk a steril körülmények szigorú betartására. Valamennyi oldatot [például Hankféle egyensúlyozott só (BSS) (különböző sók oldata, Grand Island Biological Company of Buffalo, New York), F-10 táptalaj (szabvány oldat, amely sókat, aminosavakat és cukrokat tartalmaz), magzati borjú-szérum, tripszinoldat] 35 °C körüli hőmérsékleten vízfürdőn 20 percig vagy hosszabb ideig inkubálunk használat előtt. 8 A sejteket eltávolítjuk a tumor-szövetből és in vitro tenyésztjük több generáción keresztül megfelelő táptalajban, a táptalaj leírása alább következik. Az edényeket sterilizáló oldattal, például 1,2-propanollal és amfil- vagy kreolin-oldattal (szerves antibakteriális szerek) előre öblítjük. A mesterséges, azaz in vitro több generáción keresztül tenyésztett sejteket előnyösen 250 ml-es lombikokban tenyésztjük. A táptalajt, amelyben a sejteket tenyésztjük, az előre átöblített edénybe engedjük. A sejteket ezután 5-10 ml Hank-féle BSS-oldattal vagy hasonló oldatokkal 30 másodpercig gyengén mossuk. Az elegyet nem keverjük. Valamennyi falat és felületet mossuk. Az oldatot 4 °C-on végzett centrifugálás útján megtisztítjuk a sejtektől. A centrifugálást 10 percig végezzük 3000 percenkénti fordulatszámmal. A táptalajt ismét az edénybe öntjük. Kis mennyiségű pufferolt (pH = 5—6) proteináz enzim oldatot adunk hozzá és gyorsan öblítjük, hogy a sejtek megemésztését elkerüljük. Előnyösen 1-2 ml 5 %-ós EDTA stabilizálószert tartalmazó tripszin oldatot adunk hozzá és csak 10 másodpercig öblítjük. A tripszin oldatot leöntjük. Friss tripszin oldatot adunk hozzá és addig inkubáljuk, amíg mikroszkóppal meg nem figyeljük, hogy a sejtek elválnak a kamra falától. Ez rendszerint 5-10 percig tart. Táptalajt, például 7-10%-os magzati borjúszérumot adunk hozzá 100 ml F-10 táptalajban. 25 ml friss táptalajt a sejtekkel együtt egy új tenyésztő kamrába helyezünk át tenyésztés céljából. Mindkét kamrát 35 °C-os inkubátorba helyezzük mintegy hét napra. A példa eddigi lépései szerint egy mesterséges ráksejt tenyészetet két friss tenyészetté osztunk körülbelül 7 naponta. Ezt az egész folyamatot mindkét tenyésztő kamrában annyiszor ismételhetjük meg, amennyiszer akarjuk hét napos időközökben. Ily módon az in vitro tenyésztett sejtek számát hét naponként megkettőzhetjük. Malignin előállítása céljából a sejteket hét napi tenyésztési idő után extrahálhatjuk. Minden 250 ml-es tenyésztő kamrában tenyésztett sejtet az alábbi módon nyerhetünk ki. A táptalajt centrifugacsőbe visszük át, és 3000 percenkénti fordulatszámmal 10 percig hidegen (4 °C-on) centrifugáljuk. A táptalajt eltávolítjuk. A tenyésztő kamrában maradt sejteket lekaparjuk a kamra falairól és semleges pufferoldattal bemossuk a centrifugacsövekbe. A sejteket kétszer mossuk semleges pufferoldattal, 3000 percenkénti fordulatszámmal ismét 4 °C-on centrifugáljuk és a táptalajt eltávolítjuk. A mosott sejteket 10 ml semleges foszfátpufferben szuszpendáljuk és ebben tartjuk, amíg a szuszpenziót a nyers malignin-prekurzort tartalmazó frakció extrahálására felhasználjuk. F-10 táptalaj GIBCO Laboratories glutammnal 3175 Staley Road Grand Island New York 14072/USA Szervetlen sók CaCl2 • 2H20 44,1 mg/liter CuS04 • 5H20 0,0025 mg/liter FeS04 • 7H20 0,834 mg/liter KC1 285,0 mg/liter KH2PO4 83,0 mg/liter MgCl2 • 4H20 MgS04 anhidrát 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
