185315. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vízoldható immunstimuláns glikoproteinak előállítására Klebsiella Pneumoniaeból
1 185 315 2 A találmány tárgya eljárás új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek Klebsiella pneumoniae-ből történő előállítására. Klebsiella pneumoniae-ből kivont glikoproteineket néhány francia szabadalmi leírás, így például a 2 043 475, 2 088 112 és 2 171 907 számú ismertet. A találmány közelebbről 20-35% fehérjét, 50-70% neutrális aldózokat, 3—8% glükuronsavat és 1,5—3% aldózaminokat tartalmazó, 100 000 daltonnál nagyobb molekulasúlyú, Klebsiella pneumoniae-ből extrahált új vízoldható immunstimuláns glikoproteinek előállítására vonatkozik. Neutrális aldózokként előnyösen neutrális hexózokat, például glükózt, mannózt és galaktózt használunk. A találmány szerinti eljárással kapott glikoproteinek molekulasúlyát ultracentrifugálással határozzuk meg, s három olyan frakciót kapunk, melyek molekulasúlya 100 000 daltonnái nagyobb. A találmány szerinti glikoproteineket különböző Klebsiella pneumoniae törzsekből állíthatjuk elő, előnyösen a Pasteur Intézetben 52 145 számon letétbe helyezett törzset használjuk. E glikoproteinek szerkezetének vizsgálatát, összetételének meghatározását kémiai módszerekkel, előnyösen az uronsav-részek karbodiimides redukciójával, permetilezéssel, uronos lebontással, perjódos oxidációval vagy krónr-oxiddal végzett oxidációval végezzük. A találmány szerinti előnyös glikoproteinek kb. 30%-ban savanyú aminosavat tartalmaznak. Savanyú aminosavat kifejezés alatt például aszparaginsavat vagy glutaminsavat értünk. A találmány szerinti előnyös glikoproteinek poliszacharid frakciója 1 mól glükózra vonatkoztatottan kb. 1—1,5 mól mannózt, 1—1,5 mól glükuronsavat és 2—2,5 mól galaktózt tartalmaz. A találmány szerinti új vízoldható glikoproteineket olyan módon állítjuk elő, hogy a lizált Klebsiella pneumoniae kultúrák extraktumából dialízist alkalmazó szűréssel kapott glikoprotein oldatot egy kvaternerammónium-sóval kezeljük, a felülúszó folyadékot a kivált anyagtól elkülönítjük, majd a felülúszót - mely a glikoprotein sóoldata - hidegen egy kis molekulasúlyú alkanollal kezeljük. Az így kapott újonnan kivált anyagot vízben feloldjuk, s adott esetben dializáljuk, majd liofilizáljuk. Az eljárás kiindulási anyagaként különböző glikoprotein oldatokat használhatunk, melyeket lizált Klebsiella pneumoniae kultúrákból egy bizonyos molekulasúlynak megfelelő vagy ennél nagyobb molekulasúlyú molekulák visszatartására képes kalibrált membránpórusokon (melyet a pórusállandóval jellemezünk) történő dialízist alkalmazó szűréssel kapunk. Szűrőmembránként például a kereskedelemben kapható AMICON XM50, PM30 és UM2 típusokat, előnyösen a 100 000 dalton retenciós küszöbértékkel jellemezhetőket, mint amilyen például az AMICON XM100 vagy 111P100 típusú, különösen előnyösen a 300 000 daltonnál nagyobb molekulasúlyú molekulák visszatartására képes típusokat, így például az AMICON és ROMICON XM300-zal kezdődő típussorozatokat használjuk. A megfelelő membrán kiválasztásával a dialízist alkalmazó szűrés folyamán az oldatban lévő, az adott molekulasúlynál nagyobb molekulasúlyú molekulákat — a kívánt retenciós küszöbérték függvényeként - elkülönítjük. Nyilvánvalóan az azonos minőségű, más mód- 2 szerekkel kapott — például polimerizált hidrofil gélen kromatografált - egyéb oldatok is megfelelőek. Az elkülönítési műveletet megelőzően előnyös, ha a zsírokat és nukleinsavakat eltávolítjuk. A kiindulási glikoprotein oldatokat előnyösen a 2 043 475 sz. francia szabadalmi leíráshoz benyújtott 2 171 907 sz. második pótszabadalmi bejelentés szerinti eljárás alapján kapjuk. E pótszabadalmi bejelentés szerint a glikoproteinek molekulasúlyát gélkiszorításos módszerrel határozzuk meg. Kvaterner-ammónium-sóként - mellyel a kiindulási glikoprotein oldatot kezeljük — például cetil-piridilammónium-kloridot, előnyösen trimetil-cetil-ammónium-bromidot (Cetavlont) használunk. A kvaterner-ammónium-sóval végzett kezelést követően kapott csapadékot a felülúszótól szokásos módszerekkel, például dekantálással vagy szűréssel, előnyösen centrifugálással különítjük el. A felülúszót ezután hidegen, kb. 4 °C hőmérsékleten kis molekulasúlyú alkanollal, például metanollal, etanollal, n-propanollal vagy izopropanollal kezeljük. Előnyösen etanolt használunk. Különösen előnyösen egy térfogatú sóoldatra vonatkoztatottan 4 °C hőmérsékleten éjjelen át hat térfogatrész etanollal végezzük a kezelést. A kivált anyagot vízben ismét feloldjuk, s tisztítás céljából dializáljuk. A dialízist például kollodium vagy cellulóz membránnal határolt standard dializáló egységgel végezzük. Előnyösen regenerált cellulóz membránú egységeket használunk, melynek közepes pórusátmérője kb. 24 Â, és így a 12 000-14 000 daltonnál nagyobb molekulasúlyú anyagokat visszatartja, különösen előnyösen V1SKING csöveket használunk. A dialízissel a glikoproteines oldatból a kis molekulasúlyú szennyezéseket, például az alkanol-nyomokat távolíthatjuk el. Természetesen, ha a dialízises tisztítást nem végezzük el, valamivel kevésbé tisztán kapjuk a találmány szerinti glikoproteineket. A liofilizálást a szokásos módszerekkel, például közepes méretű fagyasztó-szublimáló berendezésben, például SMU vagy SMRG típusú készülékekben (Usifroid Co.) vagy nagyméretű liofilizátorokban, például CA1 fagyasztóban és SMIRS szublimálóban (Usifroid Co.) végezzük. Kisebb méretű, laboratóriumi készüléket, például Sérail Co. készülékeit is használhatunk. A találmány szerinti eljárást előnyösen az alábbi módon végezzük: — kvaterner-ammóniumsóként cetil-trimetil-ammónium-bromidot használunk; — a felülúszót centrifugálással különítjük el; — kis molekulasúlyú alkanolként etanolt használunk. A találmány szerinti glikoproteinek előnyös farmakológiái tulajdonságokkal rendelkeznek, így különösen kedvezőek immunstimuláns sajátságaik, valamint tolerabilitásuk. A továbbiakban a kísérleti részben ismertetett példákkal illusztráljuk azokat a farmakológiai tulajdonságokat, melyek alapján a találmány szerinti glikoproteineket gyógyászati hatóanyagként használhatjuk. A találmány szerinti gyógyászati kompozíciókat például humán és állatgyógyászatban baktériumok vagy vírusok által okozott infekciók megelőzésére, paraziták okozta megbetegedések, toxikus, valamint klinikai és sebészeti beavatkozásokat követő infekciók kezelésére használjuk. Az alkalmazott dózis a humán gyógyászatban — a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
