185283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új foszforil-muramil-peptidek előállítására
1 _185283 2 1. példa 1,4 mmól 2-(hexadeciloxi-hidroxifoszforiloxi)etilaminnak és 3 mmól trietilaminnak 25 ml 65 : 25 : 4 arányú kloroform-metanol-víz eleggyel készült oldatához hozzácsepegtetünk 2 mmól N- acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamin-N-hidroxiszukcinimidésztert 6,5 ml dimetilacetamidban oldva. Az oldatot 18 órás, 20 °C-on történő keverés után csökkentett nyomáson kb. 15 ml térfogatra betöményítjük, így egy emulziót kapunk. Ezt 100 ml vízzel hígítjuk és fagyasztva szárítjuk. A maradékot 25 ml vízben szuszpendáljuk és vízzel szemben extenzíven dializáljuk. A belső dializátum tartalmazza a kívánt terméket, ezt fagyasztva szárítjuk. Az N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamin-2-(hexadeciloxi-hidroxifoszforiloxi)-etilamidot kromatográfiával tisztítjuk, melyet Sephadex L-20 töltésű oszlopon végzünk 25 : 15:4:2 arányú kloroform-metanol-ecetsav-víz eleggyel. A hozam 789 mg, az elméleti kitermelés 57%-a. Rr = 0,24 (kloroform, metanol és víz 65 : 25 : 4 arányú elegyével). Az új vegyületet analitikailag oly módon jellemezhetjük, hogy a molekulát felépítő részek közül az N-acetilmuraminsavat, a hexadekanoit, a foszfátot, az L-alanint és a D-izog!utaminsavat menynyiségileg meghatározzuk: Az N-acetil-muraminsavat mennyiségileg spektrofotometriás módszerrel határozzuk meg a J. M. Ghuyson és szerzőtársai által módosított [Methods in Enzymology 8, 629 (1966)] Morgan-Elson reakcióval. A foszfátot Lowry és szerzőtársai [J. Biol. Chem. 207, 1 (1954)] módszerével határoztuk meg mennyiségileg. Az aminosavakat és a hexadekanoit teljes hidrolizátumból (6 n sósav, 24 óra, 110 °C) aminosavanalizátorral, illetve gázkromatográfiásán határoztuk meg mennyiségileg, belső standardként norleucint illetve pentadekanolt használva. A kiindulási anyagként használt N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamin-N-hidroxi-szukcinimidésztert például a következő módon lehet előállítani: 2 mmól N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutamint, 2,2 mmól N-hidroxi-szukcinimidet és 2,2 mmól diciklohexil-karbodiimidet 6,5 ml dimetilacetamidban oldunk és az oldatot 18 órán át 20°C- on keverjük. A kivált diciklohexil-karbamidot elkülönítjük és az oldatot közvetlenül felhasználjuk a foszfolipiddel való kondenzációhoz. A 2-(hexadeciloxi-hidroxifoszforiloxi)-etilamin -melyet ugyancsak kiindulási anyagként alkalmaztunk - a kereskedelmi forgalomban kapható szintetikus termék. 2. példa a) 1 mmól (350 mg) la-benzil-2-acetamido-2- dezoxi-4,6-izopropi!idén-gliikózt 10 ml abszolút dimetoxietánban addig reagáltatunk 1 mmól ásványolajban diszpergált nátriumhidriddel, amíg a hidrogénfejlődés befejeződik. A reakcióclegyet ezután 0 °C-ra hütjük, majd erős keverés közben és a nedvesség kizárása mellett 5 ml dimetoxietánban oldott 1 mmol klóracelil-L-alanil-D-izoglutamin-2-(hexadeciloxi-hidroxifoszforiloxij-etilamidot adunk hozzá, piridinsó formájában. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, majd szobahőmérsékleten történt 3 órás állás után az elegyet vákuumban szárazra pároljuk és szilikagélen (Kieselgt 1 Merck), 7 : 3 arányú kloroform-metanol eleggyel kromatografáljuk. A kívánt végterméket tartalmazó frakciók vékonyréteg-kromatográfiás lemezen (Kieselgel Merck) pozitív reakciót adnak a V. E. Vaskovsky és E. Y. Kostetsky szerinti foszfátreagenssel [J. Lipid. Res. 9, 396 (1968)] és ugyancsak pozitívan reagálnak hevítés közben 2 n kénsavval (a cukor barna elszíneződése). Ezeket a frakciókat bepároljuk, majd a védőcsoportok eltávolítása céljából az anyagot előbb 1 órán át 12 ml jégeaet és 8 ml víz elegyéberi tartjuk 50 °C-on, majd szobahőmérsékleten és légköri nyomáson 2 súly% 10%-os palládium-szén katalizátor jelenlétében hidrogénezzük. Az a-benzil-csoport teljes leszakadása 20 óra múlva következik be, ekkor a katalizátort kiszűrjük és a szürletet vákuumban szírupsürüségüre bepároljuk. Ily módon az N-acetil-dezmetilmuramil-L-alanil-D-izoglutamin-2-(hexadeciloxihidroxifoszforiloxi)-etiIamid piridiniumsóját kapjuk szirup formájában, ezt előbb 10%-os nátriumklorid oldattal szemben, ezt követően desztillált vízzel szemben dializáljuk és igy félnátriumsóvá (heininátriumsóvá) alakítjuk. A hozam fagyasztva szárítás után 2,10 mg, az elméleti hozam 24%-a, trih drátra számítva. Az anyagot aminosav-analízissel, a P : Na viszony meghatározásával és a murám insav Morgan-Elson módszerrel történő meghatározásával (1.1 példa) jellemezzük. Rf = 0,75, Kieselgel Merck vékonyréteg-kromatográfiás lemezen; a futtatószer térfogat szerint 65 : 25 : 4 arányú kloroform-metanol-víz elegy. b) A kiindulási anyagként alkalmazott a-benzil-2-ar etamido-2-dezoxi-4,6-izopropilidén-glükóz fizikai állandói a következők: olvadáspont 136-137 °C, [ct]jí = +110° (CHCIj, c = 1), Rr = 0,55 (Kieselgel Merck vékonyréteg-kromatográfiás lemezen, dikiórmetán-metanol 5 : 1 arányú eleggyel). A klóracetil-L-alanil-D-iz:oglutamin-2-(hexadeciloxi-hidroxifoszforiloxi)-eti!amid piridiniumsóját úgy állítjuk elő, hogy 2 mmól klóracetil-L-alanil-D- izoglutamin-2-hidroxi-etilamidot 1,5 mmól foszforsav-hexadecilészterrel és 4,5 mmól triizopropilbenzolszulfonsavkloriddal szobahőmérsékleten piridinben reagáltatunk. 15 óra múlva az elegyhez 2 ml vizet adunk, 1 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, vákuumban szárazra pároljuk és a maradékot desztillált vízzel szemben dializáljuk. A kívánt foszforsav-diészter a dializáló tömlőben marad. A tömlő tartalmát szirupsürüségre bepároljuk majd a víznek azeotrop elegy formájában történő eltávolítása céljából az anyagot négyszer piridin íel kezeljük és bepároljuk. A még megmaradt vizet a további reakció előtt molekulaszitával távolíthatjuk el, dimetoxietánban. Rf = 0,35 (kloroform : metanol : víz = 65 : 25 : 4, Kícselgcl Merck vékonyréteg-kromatográfiás lemezen). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
