185264. lajstromszámú szabadalom • Javított mikrobiológiai eljárás androsztán szteroidok előállítására
1 —185 264 2 kromatografálás alkalmazása nélkül is tiszta kristályban nyerhetjük-a célterméket, az oldószert az extraktumból bepárlással eltávolítva és a maradékot ismételten átkristályosítva, pl. acetonból, hexánból, ciklohexánból vagy hasonló közegből. A tojássárgáját nem tartalmazó közegben végzett fermentációhoz képest a találmány szerinti eljárással hatékonyabban érhetjük el a szterin oldalláncának lehasitását és jóval nagyobb arányban állíthatjuk elő a kívánt androsztán szteroidot. A kiindulási anyag szterinre vonatkoztatott kitermelés is megnő. A kiindulási anyag (szterin) lebomlásának megnövekedett aránya folytán nagyobb koncentrációban is adagolhatjuk a szterint, mint tojássárgája nélküli közegben való fermentáció esetén. Összességükben ezek az előnyök lehetővé teszik az androsztán s/.teroidok jelentősen megnövelt termelékenységgel való előállítását és így a találmány szerinti eljárásnak igen nagy a gazdasági értéke. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott tojássárgája ugyanakkor a termék értékéhez képest nagyon olcsó is, ami a találmány szerinti eljárás további kiemelkedő előnye. A találmányt annak általános ismertetése után példák ismertetésével tesszük még érthetőbbé; e példákkal az ismertetési szemléletesebbé kívánjuk tenni, ezekre a találmány semmilyen vonatkozásban nem korlátozódik. Az androsztán szteroidra a példákban adott elemzéseket gázkromatográfiával végeztük, a százalékos arányok súlyszázalékok. 1. példa 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és a fennmaradó részben vizet tartalmazó oltó tápközeget (pH - 7,2) készítünk. Ebből az oltó tápközegből 100 ml-nyit töltünk 500 ml ürtartalmú rázólombikba. A lombikot és annak tartalmát autoklávban 15 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. majd a közeget oltókacsnyi mennyiségű M. parafortuitum MCÍ-1297-el inokuláljuk és az inokulált közeget 48 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, vibrációs rázógépen percenként 120 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget. Húsz (20) darab 500 mi ürtartalmú rázólombikból két tiz (10) lomo;kos csoportot képezünk. Mindegyik rázólombikba 50 ml töfenrientációs tápközeget (pH = 7,0) töltünk, melynek összetétele: 5,0% porított teljes 1,5% élesztő szójabab 0,i5% K2HP04 0,5% szójababolaj 9,1 % MgS04 • 7H20 0,1% szilikonolaj 2,0% koleszterin t 1,0% szárított tojássárgája a többi víz. (A szilikonoiajat a Shin-etsu Chemical industry Co., Ltd. cég „KM-70” védjeggyel forgalmazza). A lombikokat és tartalmukat autoklávban 20 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk. Mindegyik lombikot inokuláljuk a fentiek szerint kapott oltótenyészettel, 2 ml mennyiséggel. A főfermentációt 30 °C hőmérsékleten vezetjük le vibrációs rázógépen, percenként 120 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget. Az inkubáció kezdetétől számított 140 óra múlva fejezzük azt be az első csoportnál, 210 óra múlva a második csoportnál. Mindkét csoportnál kétszer extraháljuk a kombinált fermentlevet, 1-1 liter etil-acetáttal. Ezután szűréssel eltávolítjuk a kombinált extraktumból az oldhatatlan közeget, pl. a sejteket, majd a szürlet szteroidtartalmát meghatározzuk gázkromatográfiás elemzéssel. Az első, illetve második csoport extraktumaiban a képződött 9ct-OH-4AD tartalom 1,65 g, illetve 1,85 g. Az eljárást megismételjük egyébként azonos öszszetételü, de tojássárgáját nem tartalmazó főfermentációs közeggel. Ismét tíz-tíz lombikos két csoportban összesen húsz lombikot inkubálunk 140, illetve 210 órán át és a fermentlevet is egyező módon extraháljuk. Az extraktumok elemzése a céltermék szteroidtartalomra nézve azt mutatja, hogy a két csoportban a célterméktartalom megfelelően 0,94 g, illetve 1,38 g 9a-OH-4AD. 2. példa 1,0% glükózt, 1,0% húskivonatot, 1,0% peptont és a fennmaradó'részben vizet tartalmazó oltó tápközeget (pH = 7,2) készítünk. Ebből az oltó tápközegböl 100 ml-nyit töltünk 500 ml ürtartalmú rázólombikba. A lombikot és annak tartalmát autoklávban 15 percen át 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk, majd a közeget oltókacsnyi mennyiségű M. vaccae MCI-1104-el inokuláljuk és az inokulált közeget 48 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, vibrációs rázógépen percenként 120 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget. Két (2) darab 500 ml ürtartalmú rázólombikba 50-50 ml főfermentációs tápközeget (pH = 7,0) töltünk, melynek összetétele: 4,0% porított, 2,0% élesztő zsírtalanított szójabab 1,0% szójababolaj 1,0% rizskorpa 0,2% NaN03 0,1% K2HP04 0,1 % MgS04 • 7H20 1,5% koleszterin 0,5% szárított a többi víz tojássárgája A lombikokat és tartalmukat autoklávban 20 percen át 120 *C hőmérsékleten sterilizáljuk. Mindegyik lombikot inokuláljuk a fentiek szerint kapott oltótenyészetből 20 ml mennyiséggel. A főfermentációt 30 °C hőmérsékleten, vibrációs rázógépen vezetjük le, percenként 100 (7 cm kitérésű) lökettel rázva a közeget, az egyik lombiknál 144 órán, a másik lombiknál 192 órán át. Mindegyik fermentlevet kétszer extraháljuk 100-100 ml etil-acetáttal. Az extraktumok elemzése azt mutatja, hogy a 9a- OH-4AD célterméktartalom megfelelően 95 mg, illetve 115 mg. A fent leírt eljárást megismételjük egyébként egyező összetételű, de tojássárgáját nem tartalmazó főfermentációs tápközeggel és ugyancsak 144, illet-I 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
