185263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az immunszabályozást befolyásoló, TP5-analóg peptidek előállítására

1

185 263

2

A találmány tárgya eljárás az immunszabályozást ^ befolyásoló új peptidek előállítására.

Az utóbbi években végzett vizsgálatok egyértelműen igazolták, hogy a timuszhormonok közvetlenül részt vesznek a T-limfocitafüggő immunológiai 5 egyensúlyt szabályozó folyamatokban. Feltehetően a fiatal T-sejteket érett, differenciálódott sejtekké alakítják, melyek viszont központi szerepet játszanak a sejtközvetített immunitásban és az immunválaszok különböző típusainak szabályozásában. 10 A timuszhormonok nemcsak a timuszban, hanem ezen kívül is hatnak, és szerepet játszanak a citotoxikus, szupresszor és helper sejtek kialakulásában.

A timuszkivonatokkal immundeficiens és rákos betegeken végzett előzetes klinikai vizsgálatok ered- 15 ményei további lendületet adtak a kutatásnak.

A módszerek fejlődésével megállapították továbbá, hogy a szérum timuszszintje csökkent például Di- George-szindrómában, IgA-hiányban és az általános bőrtuberkulózisban, viszont nőtt rheumatoid 20 arthritisben szenvedőknél. Kézenfekvő tehát az elképzelés, hogy a hormonszint szabályozásával ezek a betegségek is kedvező irányban lesznek befolyásolhatóak (E. Arrigoui-Martelli: Drugs of Today 16, 203 [1980]). 25

Ma már több timuszhormont sikerült egységes állapotban izolálni, szerkezetüket felderíteni, sőt szintetizálni is. Ezek közé tartozik a 49 aminosavból felépülő timopoietin (Goldstein és munkatársai: Nature 247, 11 [1974]; Goldstein és munkatár- 30 sai: Ann. N. Y. Acad. Sei. 249, 177 [1975];

4 002 740 és 4 071 949 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás). A természetes, majd a szintetikus termékkel (Fujino és munkatársai: Chem. Pharm. Bull. 25, i486 [1977]; Bliznakov cs 35 munkatársai: Biochem. Biophys. Res. Commun.

80, 631 [1978]) egyértelműen igazolni lehetett in vitro és in vivo a timopoietinnek a T-sejtek differenciálódását indukáló hatását.

Minthogy a természetes forrásból származó 40 anyag nem elegendő a szükségletek fedezésére, a szintetikus terméknek viszont a magas ára gátolja a gyakorlati alkalmazást, azonnal megindult a kutatás a timopoietin aktív centrumának földerítésére, Először egy tridekapeptidről, a timopoietin-(24- 45 41)-ről (Schlesinger és munkatársai: Cell 5, 631 [1978]) majd a TP5-nek elnevezett pentapeptidről, a timopoietin-(32-36)-ról állapították meg, hogy rendelkezik a teljes hormon valamennyi biológiai tulajdonságával (Goldstein és munkatársai: Seien- 50 ce 204, 1309 [1979]; 4 190 646 sz. amerikai egyesült államokbeli szabádalmi leírás). Újabban leírták a TP5 egyes fragmenseit és analógjait is, de ezek a vizsgált rendszerben nem voltak hatékonyak (Abiko és munkatársai: Chem. Pharm. Bull. 28, 2507 55 [1980]).

Azt találtuk, hogy ha a TP5 láncrövidítését nem az N-terminális részről kezdjük, ahogyan ezt a japán kutatók tették (Abiko és munkatársai: Chem. Pharm. Bull. 28, 2507 [1980]), hanem a C-terminá- 60 lis részről, akkor a H-Arg-Lys-Asp-Val-OH tetrapeptid, sőt a H-Arg-Lys-Asp-OH tripeptid is aktívnak bizonyul, növeli az E-rozettát képző limfociták számát. A jelen találmány a fenti tetra- és tripeptidnek, valamint ezen néhány analógjának szintézisére 65

vonatkozik. Az analógok között meglepő módon találtunk olyan származékokat is, amelyek ellentétes biológiai hatást mutattak. Ezzel elsőnek szolgáltattunk példát arra, hogy immunválaszt indukáló és gátló hatás igen közeli szerkezeti elemekkel kapcsolatos. Valamennyi előállított vegyület új termék.

A találmány szerinti vegyületek szintézisét oldatban, a lépésenkénti felépítés elvét követve, ismert peptidkémiai módszerekkel végeztük. A szintézis során olyan védőcsoportkombinációt alkalmaztunk, amely lehetővé teszi a szelektív eltávolítást és a védett peptidről a védőcsoportok lehetőleg egy lépésben való eltávolítását. A peptidkötés kialakítására a legtöbb esetben az általunk kidolgozott pentafluor-fenil-észteres eljárástalkalmaztuk (Kisfaludy és munkatársai: 168 43! sz. magyar szabadalmi leírás; Kisfaludy és munkatársai: Tetrahedron Letters 1785 [1974]).

A találmány tehát eljárás az immunszabályozást befolyásoló (I) általános képletű peptidek

X-L-arginil-L-lizil-Y (I)- ahol X hidrogénatomot és Y L-aszparaginsav-, L-aszparagil-L-valin-, L-aszparaginil-L-valin-, L-2-aminoszukcinil-L-valin-, L-alanil-L-valin-, L-aszparagil-L-alanin-, L-glutamil-L-valin- vagy L-aszparagil-L-izoleucin-csoportot vagy pedig X L-piroglutamilcsoportot és Y L-aszparaginsav-, L-aszparagil-L-valin- vagy L-aszparagil-L-valil- L-tirozin-csoportot képvisel - valamint sóik, amidjaik és rövidszénláncú alkilésztereik, valamint az arginilcsoport guanidinocsoportján nitro-, a lizilcsoport e-aminocsoportján és az N-terminális aminocsoporton benziloxikarbonil- és a C-terminális karboxilcsoporton adott esetben benziloxi- vagy

4-nitro-benziloxi-védőcsoportot, továbbá az adott esetben jelen levő aszparagil- és/vagy glutamilcsoport láncvégi karboxilcsoportján benziloxi- és a tirozin fenolos hidroxilcsoportján benzil-védőcsoportot tartalmazó védett származékaik előállítására, amelynek során a peptidlánc tagjait a C-terminális aminosavból, illetőleg annak amidjából, rövidszénláncú alkilészteréből vagy N-védett származékából kiindulva lépésenkénti acilezéssel kondenzáljuk, célszerűen az aktív-észteres és/vagy vegyes anhidrides acilezési módszer alkalmazásával és kívánt esetben a védőcsoportot tartalmazó peptidtermékről a védöcsoportot lehasítjuk és a só alakjában kapott pepiidből a bázist felszabadítjuk és/ vagy kívánt esetben a kapott terméket valamely gyógyászatilag alkalmazható sóvá alakítjuk.

Az eljárás egy különösen előnyös megvalósítási módját a H-Arg-Lys-Asp-Val-OH tetrapeptid szintézise szemlélteti. L-Valin-p-nitro-benzil-észtert N-tercier-butil-oxi-karbonil-L-aszparaginsav-bétabenzil-észter-alfa-pentafiuor-fenilészterrel acilezünk, a kapott védett dipeptidröl szelektíven eltávolítjuk a tercier-butil-oxi-karbonil-csoportot, majd a szabad dipeptidel N-alfa-tercier-butil-oxikarbonil-N-epszilon-benzil-oxi-karbonil-L-lizinpentafluor-fenilészterrel acilezzük. A védett tripeptid trifluor-ecetsavas kezelése az N-terminâlisçm szabad tripeptidet eredményez, amelyet N-benziloxi-karbonil-G-nitro-L-arginin-pentafiuor-fenilészterrel acilezünk. Az így kapott védett tetrapeptid valamennyi védőcsoportja egy lépésben eltávolit-2