185021. lajstromszámú szabadalom • Eljárás ciklusos hexapeptidek előállítására
1 2 AcUnoplanes sp. NRRL 8122 Actinoplanes sp. NRRL 12065. Actinoplanes sp. NRRL 12064 Az A. utahensis NRRL 12052 törzset az American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parkiawn Drive, Rockville, Md.. 20852 törzsgyűjteményéből származik (A. utahensis ATCC 14539). Az A. utahensis ATCC 14539 törzset szintén felhasználhatjuk enzimforrásként. Az A. mossourinesis NRRL 12053 törzs szintén az ATCC törzsgyűjteményből származik (A. míssouriensis ATCC 14538), és ez is enzimforrás. Az Actinoplanaceae családba tar.tozó mikroorganizmusok adott törzseinek a jelen találmány szerinti acilhasítási reakcióban való hatásosságát, az alábbi eljárással állapítjuk meg. A mikroorganizmussal beoltunk egy előnyös összetételű táptalajt. A tenyészetet 2 vagy 3 napon át körkörös rázógépen 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük. Ezután hozzáadjuk az egyik, szubsztrátként alkalmazott antibiotikumot a tenyészethez. A tenydszlé ph-ját 6,5-ös értéken tartjuk. A tenyésztés során az aktivitást Candida albicans mikroorganizmussal végzett érték-méréssel határozzuk meg. Az antibiotikum aktivitás csökkenése azt jelzi, hogy a mikroorganizmus az acilhasítási reakciót katalizáló enzimet termeli. Ezt azonban az egyik, alábbi módszerrel bizonyítani kell: 1) a telje? alapváz jelenlétét bizonyítandó, nagynyomású folyadékkromatográfiás analízist végzünk, vagy 2) megfelelő oldallánccal újra-acilezzük a vegyületet, például linoleoil-, sztearoil-, palmítoil- vagy mirosztoil-oldallánccal, az aktivitás visszaállítására. 2. Az enzimtermelés körülményei Az enzimtermelés azon körülmények között történik, amely előnyös az Actionplanaceae növekedésének, azaz 25 °C és 30 °C közötti hőmérsékleten, 5,0 és 8,0 közötti pH-n, keverés és levegőzés közben. A táptalajnak tartalmaznia kell: a) felhasználható szénforrást, például szacharózt, glükózt, glicerint vagy másokat, b) nitrogénforrást, például peptont, karbamidot, ammónium-szulfátot vagy másokat^ c) foszfátforrást, például oldható foszfát sót, végül d) szervetlen sókat, amelyek általában növelik a mikroorganizmusok növekedését. Hatásos mennyiségű enzimet a növekedési fázist követő 40—60. órában kapunk, amikor a gyors növekedést követően bizonyos idő már eltelt. A termeit enzim mennyisége a használt fajtól függ, és a különböző növesztési körülményektől. Ahogy az a területen tájékozott szakember számára nyilvánvaló, a mikroorganizmusok, így az Actinoplanes utahensis NRRL 12052, vagyis az enzimet termelő mikroorganizmus is variálhat. Így például mesterséges variánsokat és mutánsokat lehet kani ezen törzsekből, különböző ismert mutagének, például ultraibolya sugárzás, X-sugarak, nagyfrekvenciájú hullámok, radioaktív sugárzás és kemikáliák segítségével. Az összes természetes és mesterséges variáns és mután, amely a fenti törzsekből származik, és amely termeli az enzimet, használható a jelen találmány szerinti eljárásban. 3 Az acilhasítás körülményei A szubsztrátot előnyösen azután adjuk az Actinoplanaceae tenyészetéhez, miután a törzset legalább 48 órán át inkubáltuk. A szubsztrát koncentrációja az át- ' alakító táptalajban széles határok között változhat. Az enzim maximális kihasználása érdekében, és a gyakorlatilag teljes dezacilezés 24 órán belüli bekövetkezésére azonban általában milliliterenként 0,5 mg és 1,0 mg közötti mennyiségű szubsztrát koncentrációt használunk. Adagolhatunk kevesebb szubsztrátot is, akkor azonban az enzim nincs maximálisan kihasználva, magasabb szubsztrát-koncentráció alkalmazása esetén a fermentációs idő meghosszabbítása nélkül nem teljes a dezacilezés. A szubsztrát antibiotikumok találmány szerinti megfelelő alapvegyületté való átalakulása abban az esetben történik leggyorsabban, ha a fermentációs táptalaj pH-ját 6,0 és 7,0 közötti értéken tartjuk. pH = 6-on, vagy ennél alacsonyabb értéken lassú a dezacilezés, ahogy a pH érték 6,0 fölé emelkedik, mind a szubsztrát, mind pedig a keletkező alapvegyület egyre kevésbé stabil. Maximális stabilitást 6,0 pH-n érjük el, azonban 6,0 pH értéken a dezacilezés lassabban következik be, körülbelül 30-36 óra alatt. A gyorsabb dezacilezés (24 óra) érdekében 6,5 pH értéken fermentálunk, ekkor nagyobb veszteség nem következik be. A kevert fermentqrokban a pH értéket szenzorokkal szabályozhatjuk. Ahol ez nem praktikus, például lombikfermentorban, ott a pH-t 0,1 mólod foszfát-puffer adagolásával oldjuk meg, amit a szubsztrát adagolása előtt adunk a táptalajhoz. A szubsztrát adagolását követően 24 órán át, vagy tovább kell folytatnunk a fermentációt. A szubsztrát tisztasága befolyásolja a dezacilezés mértékét. Például ha 50%-osnál nagyobb tisztaságú szubsztrátot használunk, úgy az 24 órában 0,8—1,2 mg/ml antibiotikum mennyiségben dezacileződik. Ha a szubsztrát kevésbé tiszta, úgy a dezacilezés lassabban folyik. Adagolhatunk szubsztrátot több alkalommal is. így például kis fermentorokba milliliterenként 0,3- 0,5 mg antibiotikumot adunk 12 órás időszakonként, legalább öt alkalommal. A nagyobb fermentorokba két alkalommal milliliterenként 0,5 mg-ot juttatunk. A dezacilezési reakciót széles hőmérséklet-határok között véfezhetjük, például 20 °C és 45 °C között. Előnyös azonban, ha a dezacilezési hőmérséklet 25 °C és 35 °C, még előnyösebben 26 °C-ra állítjuk be, ilyenkor optimális a dezacilezés, és a legstabilabb a szubsztrát és az alapvegyület. 4. Szubsztrátként előnyösen tisztított antibiotikumokat használunk. A szubkután antibiotikumoknak gombaellenes hatása van, baktériumellenes aktivitása viszont nincs. így a szubsztrát anyagabaktériumsejteket vagy spórákat hordozva fertőzheti a dezacilezési reakció alatt a fermentációs táptalajt. Ezek a fertőzések befolyásolhatják a dezacilezési reakciót, vagy a kiindulási antibiotikumok és a termékként kapott alapvegyületek stabilitását. Ezért fontos, hogy a szubsztrátokat sterilen adagoljuk. Mivel az autoklávozás során a legtöbb szubsztrát antibiotikum bomlik, előnyösen etilén-oxiddal sterilezzük a készítményeket nyomás alatti rendszerben. 5. A dezacilezési reakció követése A kiindulási anyagoknak gombaellenes aktivitása van, különösen Candida albicans mikroorganizmussal szemben. Ily módon a jelenlévő szubsztrát menynyiségét C. albicans mikroorganizmussal szembeni érték-méréssel határozzuk meg. A keletkező alapvegyület vízben oldódik, biológiailag azonban inaktív. A biológiai aktivitás redukálódása ily módon gyors, 185.021 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7
