184925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás életképes sejtekké visszaalakuló streptomyces protoplasztok előállítására
11 184925 12 4, táblázat Kísérlet száma A szülők 1, szülő markerci+ 2. szülő PEG + + kezelés Hígító oldat Prototróf rekombinánsok vagy revertánsok/ml4 + + Spektinoniiem rezisztens prototrófok i. metA arg spc metB-h P fi-PEG 2,4 xlO4 6/7 2. metA arg spc metB P 6,6 xlO3 8/8 3. metA arg spc metB h2 o 7,0x10’ 11/11 4. metA arg spc — _L » Pfi-PEG <10’ 0/0 5. met A arg spc — P <10* 0/0 6. metA arg spc — h2 o <10’ 0/0 7. — metB ~ Pfi-PEG 2x10’ 0/3 8. —. metB A P 2x10’ 0/6 9. — metB — H20 2xl0‘ 0/8 10. metA arg spc cysD P 1,1 xlO5 NM 11. —. cysD-L. P <10’ NM 12. metA arg spc — 1 P <10‘ NM * Hopwood és munkatársai (Bact. Rév., 57, 371—405, 1973) szerint. A metA, arg és metB markerek auxotrófiát jelölnek. Az scp marker 50 [zg/ml spektinomicinre való rezisztenciát jelent. ** PEG: polietilén-glikoi. *** R2 táptalajon határoztuk meg. NM=nincs meghatározva. Amikor a protoplasztokat centrifugáltuk, és polietilén-glikolt nem tartalmazó P táptalajban szuszpendáltuk, kismértékű, de szignifikánsan jelentkező rekombinációt kaptunk. Az ilyen mértékű protoplaszt-fúzió valószínűleg a pufferban lévű Ca-ionok jelenlétének tulajdonítható. Ha a protoplasztokat desztillált vízzel hígítjuk, úgy a rekombinánsok száma százszor kevesebb. 40 A metAarg genetikai markereket hordozó törzsekből származó összes genetikai rekombináns hordozta az spc markert, ami azt jelenti, hogy a metB törzs esetleges reverziója az eredményeket nem hamisította meg. A kétszeres markert hordozó auxotróf törzs sohasem rever- 45 tált piototróffá, ami kizárja a reverzió okozta, és az eredményekben mutatkozó hibákat. A 4. táblázatban megadott eredmények további kontrolijai azt jelzik, hogy rekombináció a protoplasztok fúzióját követően nem következik be. Újraoltás után az 50 összes kiválasztott rekombináns stabilnak bizonyult. A kísérletekben használt Streptomyces fradiae törzs tilozin nevű antibiotikumot termel. A Streptomyces fradine törzs sok genetikai rekombinánsa termeli a tilozint. 5. példa Az alábbi genetikai keresztezésekben a Streptomyces griseofuscus törzset használjuk. A 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a) Tripticase-szója táptalajt 0,8%, glicinncl egészítjük ki és b) a rekombináns telepeket 34 °C hőmérsékleten 7 napon át végzett tenyésztést követően számoljuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban adjuk meg. Mind 35 a hat kísérletben polietilén-glikollal kezeltük a protoplasztokat, P oldattal hígítottuk a szuszpenziót, és R2 táptalajra szélesztettük. A genetikai rekombinánsok gyakorisága az összes esetben 103—104-szer nagyobb volt, mint a prototróf revertánsok száma. 5. táblázat Kísérlet száma A szülők markerei Prototróf rekombinánsok vagy revertánsok száma milliliterenként 1. szülő 2. szülő í met arg 3,1 xlO4 2 met trp 4,8 xlO3 3 arg trp 4,2 xlO4 4 met — o V 5 arg — 1,0x10’ 6 trp — o V Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás jó hatásfokkal életképes sejtekké visszaalakuló Streptomyces protoplasztok és az életképes sejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a Streptomyces törzs tenyészetét az exponenciális és a 60 stacioner (nyugvó) növekedési szakasz közötti átmeneti növekedési fázis eléréséig tenyésztjük, majd a sejteket lizozimmal kezelve protoplasztokat készítünk, és kívánt esetben az életképes sejteket regeneráljuk a protoplasztokból. 65 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatositási mód-7
