184925. lajstromszámú szabadalom • Eljárás életképes sejtekké visszaalakuló streptomyces protoplasztok előállítására
7 184925 8 kísérletből származó átlagolt adatokat ismertetünk az 1 táblázatban. A korai exponenciális növekedési szakaszból vett sejtekből (generációs idő: 2,7 óra; 1. kísérlet) csak igen gyenge hatásfokkal keletkeztek protoplasztok. Ha 16 órán ál 34 "C-on végeztük az inkubációt. a sejtek csak kis része alakult protoplaszttá. Ha a tenyészet A600-értéke 0,46 volt, a sejtek 1—2 óra alatt protoplaszttá alakultak, amelyek jó hatásfokkal életképes sejtekké regenerálódtak. Ahogy a sejtek a középkésői exponenciális növekedési fázisba léptek (A600 0j—1,4), ezt a tulajdonságukat gyorsan elvesztették. Amikor a sejtek az exponenciális és stacioner (nyugvó) növekedési fázis között elhelyezkedő átmeneti szakaszba kerültek (A600 1,4), bár lassú ütemben, de folytatták növekedésüket (generációs idő 11,5 óra), és visszanyerték azt a képességüket, hogy protoplasztokból igen jó hatásfokkal életképes sejtekké regenerálódjanak. Az elért legmagasabb telepképző egységszám 8,6x 307/OD az élő sejtek 40%-át jelenti. Amikor a sejtek a stacioner 5 növekedési fázisba kerültek (A600>- .8,5), gyorsan elvesztették azt a tulajdonságukat, hogy protoplasztból életképes sejtté regenerálódjanak. A legérzékenyebb növekedési szakaszból (A600 2—4) 10 vett sejtek protoplasztjai regenerálódásának mértéke legalább 30-szor nagyobb, mint a középső-késői exponenciális növekedési szakaszban és legalább háromszázszor nagyobb, mint a stacioner növekedési szakaszban lévő sejtekből készített protoplasztoké. 15 A kísérletek eredményét az 1. táblázatban adjuk meg. 1. táblázat Kísérlet száma Sejtopiikai sűrűség tOD) Növekedési szakasz Protoplasztok képződése Telepképző egység/OD + Hipertóniás Hipotoniás táptalaj í 0,16 exponenciális nagyon gyenge NM NM í 0,18 exponenciális nagyon gyenge NM NM í 0,30 exponenciális nagyon gyenge NM NM í 0,32 exponenciális nagyon gyenge NM NM í 0,38 exponenciális nagyon gyenge NM NM 2 0,46 exponenciális jó 5 x 107 <1,1 x 103 2 0,72 exponenciális késői jó 6,8 xlO6 <6,4 x 102 2 1,46 exponenciális késői jó 2.7 xlO6 <3,4 XlO2 3 1.4 exponenciális nagyon jó 4,5 x 107 <2,1 xlO2 3 2,2 átmeneti nagyon jó 8,6 xlO7 3,2x10’ 3 3,7 átmeneti nagyon jó 8.6 xlO7 6,8x10’ 3 8,5 átmeneti nagyon jó 6,5 xlO7 8,7x10’ 4 9,0 stacioner nagyon jó 2,5 x 105 4,7 xlO3 * A sejtsűrűséget a protoplasztok képzése előtt határoztuk meg. NM = Nincs meghatározva. 2. példa Az 1. példában megadott eljárás szerint 0,8% glicint tartalmazó Tripticase-szója táptalajban Streptomyccs griseofuscus törzset tenyésztünk. Az 1. példában megadottak szerint eljárva protoplasztokat készítünk a sejtekből, majd szélesztjük őket, a telepek számát azonban a 7. napon határozzuk meg. Ahogy az a 2. táblázat adataiból kiderül, az 1. példában a Streptomyces fradiae sejtekkel végzett kísérletekhez hasonlóan a Streptomyces griseofuscus sejtjei is az átmeneti növekedési szakaszban (A600 3,5—5,0) alakulnak át protoplaszttá és regenerálódnak a legjobb hatásokkal. A kapott 1,1 x 108 telepképző egység/OD közel 100%-os regenerációt jelent a lehetséges összes életképes sejtre számítva. A korai exponenciális növekedési szakaszban lévő sejtek szintén nem alakulnak át protoplaszttá, a stacioner növekedési 45 szakaszban lévő sejtek pedig szintén nem regenerálód nak protoplaszt-képzés után életképes sejtekké (kevesebb mint 5,8 < 103 telepképző egység/OD). Ezek szerint a stacioner fázisban lévő sejtekből készült protoplaszlok több mint tízezerszer gyengébb hatásfokkal alakul- 50 nak vissza életképes sejtekké, mint átmeneti növekedési szakaszban lévő sejtekből készített protoplasztok. A kísérletek eredményeit részletesen ismertetjük a 2. táblázatban. 2. táblázat Kísérlet száma Sejt- _ optikai sűrűség (OD; Növekedési szakasz Protoplasztok képződése Telcpkcpző egység/OD + Hipertóniás Hipotoniás táptalaj í 16 exponenciális nagyon gyenge NM NM í 23 exponenciális nagyon gyenge NM NM i 35 exponenciális nagyon gyenge NM NM í 42 exponenciális nagyon gyenge NM NM i 54 exponenciális késői nagyon gyenge NM NM 5
