184814. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinészteráz előállítására
1 184 814 2 A találmány tárgya eljárás koleszterinészteráz előállítására mikroorganizmusok segítségével, lecitint tartalmazó táptalajban. A koleszterinészteráz fontos szerepet játszik a klinikai és a biokémiai analitikában, mióta koleszterin enzimatikus meghatározására eljárásokat dolgoztak ki. Mivel biológiai anyagban a koleszterin nagy része észterek formájában fordul elő, koleszterinészteráz és koleszterint oxidáló enzimek, például koleszterinoxidáz vagy koleszteríndehidrogenáz együttes alkalmazása koleszterin-észterek teljesen enzimatikus meghatározását is lehetővé teszi. Ez a 2 264 847 sz. német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírásból ismeretes. A koieszterinészteráz-meghatározás keretén belül különösen előnyösnek bizonyult emellett a mikroorganizmusokból kinyert enzim. (25 06 712,3 sz. német szövetségi köztirsaságbelí nyilvánosságra hozatali irat). A feldolgozásra érdemes koleszterinészteráz-tartalommal rendelkező eddig felfedezett mikroorganizmusok hátránya azonban a viszonylag alacsony kitermelés a kapott enzimaktivitásra számítva. Az ismert eljárások esetében a tenyésztés rendszerint olyan táptalajon történik, amely valamilyen induktort tartalmaz. „Indaktor”-on itt olyan anyagot értünk, amely a mikroorganizmust arra ösztönzi, hogy a kívánt enzimet kizárólagosan vagy nagyobb mennyiségben termelje, mint induktor nélkül. A mikroorganizmusoknak rendszerint nincs szükségük koleszterinészterázra, mivel elegendő más tápanyag áll rendelkezésükre, és egy szükségtelen enzim képződése a sejtnek nem gazdaságos. Az induktorok ezért koleszterin-észterek vagy kémiailag hasonló vegyületek. Meglepő módon azt észleltük, hogy egy bizonyos, a koleszterin-észterektől kémiailag távol álló induktor alkalmazásakor többszörösen nagyobb aktivitást érhetünk el, mint ami eddig lehetséges volt. A koleszterinész. teráz mikroorganizmusokból, való kinyerésére szolgáló találmány szerinti eljárásra ezért az jellemző, hogy egy kolesztermészteráz-képzésre képes mikroorganizmust alkalmas táptalajban lecitin induktor jelenlétében tenyésztünk, és az enzimet a tenyészet folyadékából vagy/és a sejtekből kinyerjük. Előnyösen a találmány szerint hozzáadott induktort szérrforrásként, főleg egyedüli szénforrásként is alkalmazzuk. Lehet azonban külön szénforrásokat is hozzáadni, például kukorica áztatóvizet, peptonokat, élesztőextraktumot valamint kevésbé alkalmasan, cukrokat vagy polialkoholokat, például glicerint. A különböző lecitinek közül különösen alkalmasnak bizonyult a szójalecitin, de más lecitinféleségek, például tojáslecitin vagy agyvelőlecitin is jó eredményeket adtak. A hozzáadott lecitinmennyiség általában a táptalaj térfogatára vonatkoztatott 0,1 és 5 súly% között van. Lecitin induktorként és egyedüli szénforrásként való alkalmazásakor különösen jó eredményeket 0,5—2 súly%nyí mennyiségnél kaptunk. A találmány részére elvileg minden olyan mikroorganizmus megfelel, amely feldolgozásra alkalmas mennyiségben képes koleszterinészterázt termelni. Ilyen mikroorganizmusok nagy számban ismertek. Alkalmasak például a következők: Candida rugósa ATCC 14830 Rhizopus spec. DSM 695 Aspergillus spec. DSM 698 Streptomyces aureoverticillium DSM 40080 Streptomyces cyaneofuscatus DSM 40148 Streptomyces griseomycini DSM 40159 Streptomyces longisporus-fl. DSM 40165 Streptomyces malachiticus DSM 40167 Streptomyces roseolus DSM 40174 Streptomyces toxytricíni DSM 40178 Streptomyces variábilis DSM 40179 Streptomyces spec. DSM 687 Streptomyces autotrophicus DSM 40011 Streptomyces canescens DSM 40528 Streptomyces chartreusis DSM 40085 Streptomyces michiganensis DSM 40015 Streptomyces murinus DSM 40091 Streptomyces hachijoensis DSM 40114 Streptomyces caelestes DSM 40084 Streptomyces tendae DSM 40101 Nocardia rubra DSM 43008 Candida mycoderma DSM 688 Candida albicans DSM 689 Candida albicans DSM 690 Candida albicans DSM 691 Candida spec. DSM 692 Cunninghamella elegáns DSM 693 Mucor mucedo DSM 694 Pénicillium spec. DSM 696 Aspergillus spec. DSM 697 Pseudomonas fluorescems ATCC 31156 Pseudomonas fluorescens IAM 1051 Pseudomonas fluorescens ATCC 948 Pseudomonas fluorescens KY 4032 Pseudomonas fluorescens iFo: 3081 Pseudomonas spec. IAM 18002 és 180001 Különösen előnyös a Pseudomonas spec. DSM 1280 és 1281. Egy különösen előnyös táptalaj, amely különösen a Pseudomonas fajok részére alkalmas, ezenkívül még szokásosan hozzáadott sókat és nyomelemeket tartalmaz, és pH-ját alkalmas puffer hozzáadásával 5 és 9 közötti pH-ériékre, előnyösen 6 és 8 közötti pH-értékre kell beállítani. Pufféiként foszfátpuffer előnyös. A táptalaj ezenkívül még ammonium-, klorid-, vas-, réz-, cink-, magnézium- és kalcium-ionokat is tartalmaz, eltekintve a foszfátpuffer alkálifém-ionjaitól. A foszfát célszerűen 0,4 és 2 súly% közötti koncentrációban fordul elő, alkalmazható azonban nagyobb vagy kisebb koncentráció is. A találmány szerint egyik különösen előnyös táptalaj körülbelül a következő összetételű, 1 liter folyadékra vonatkoztatva: 5-10 g, előnyösen 6-8 gNa2HP04 • 2 H20; 1—5 g, előnyösen 2-4 g KH2P04 ; 0,2-2 g, előnyösen 0,8—1,2 g NH4C1; 0,01- 0,1 g, előnyösen 0,03-0,07 g NaCl; 0,01-1 mi. 1 %-os Fedj -oldat; 0,01-1 ml 0,2 %-os CuCl2-oldat; 0,01—1 ml 1 %-os cink-szulfát oldat; 0,1—10 ml 10 %-os CaCl2-oldat; 1—20 ml, előnyösen 3—10 ml 12 %-os MgS04-oldat; 0,1—5 súiy%, előnyösen 0,5—2 súly% szójalecitin. A különösen előnyös mikroorganizmusok tenyésztését a fenti táptalajokban aerob körülmények között végezzük. Megfelelők mind rázatott tenyészetek mind levegőztetett merített tenyészetek. A hőmérséklet körülbelül 15 és 45 °C között lehet, előnyösen 25—35 °C-on. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
