184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 184.736 ja. A csúcsoknak megfelelő frakciók kecske anti-nyúl IgG anyaggal szemben mutatott antigén-ellenanyag reakcióját is mértük, hogy meghatározzuk a Fab’ fragmentum koncentrációját a csúcsoknak megfelelő frakciókban. A kapott eredményeket a 3. ábrán a szaggatott-pontozott vonal mutatja. A 3. ábrából a következő következtetés vonható le. Az 1. csúcsnak megfelelő, legnagyobb molekulasúlyú protein nem mutat ADP-ribóz-transzferáz aktivitást EF-2-vel szemben, és csak a Fab fragmentumot tartalmazza, következésképpen feltehetően ez a csúcs felel meg a Fab’ fragmentum dimerjének. A 2. csúcsnak megfelelő protein rendelkezik transzferáz aktivitással, és szintén tartalmaz Fab fragmentumod ennek alapján feltehetőleg ez a csúcs felel meg a Fab fragmentum és az A fragmentum reakciótermékének. A 4. csúcsnak megfelelő protein egy csupán Fab fragmentumot tartalmazó protein és egy Fab’ fragmentumot nem tartalmazó protein elegyéből áll, transzferáz aktivitással rendelkezik, ezért feltehetően a Fab fragmentum és az A fragmentum dimerjének elegye. A 4. csúcsnak megfelelő protein, amely a legkisebb molekulasúlyú, nem tartalmaz Fab’ fragmentumot, de rendelkezik transzferáz aktivitással, ennek következtében feltételezhető, hogy az A fragmentummal azonos. E feltételezéseket támogatták a nátrium-dodecil-szulfát elektroforézises vizsgálatok, amelyek során a 2. csúcsnak megfelelő dimer (a 37. vagy 38. frakció), az A fragmentum dimerje, a Fab’ fragmentum és az A framentum mozgékonyságát vizsgáltuk. A 4. ábrán a 2. csúcsnak megfelelő F(ab'j) protein, az A fragmentum dimere, a Fab’ és az A fragmentum mozgékonyságát mutatjuk be, a kisebb mozgékonyság vagy a növekvő molekulasúly sorrendjében. Ez a sorrend megfelelő az 1., 2., 3. és 4. csúcsok sorrendjének, azaz a 3. ábrán követett sorrendnek. A 4. ábrán látható, hogy a 2. csúcsnak megfelelő protein molekulasúlya körülbelül 7-szer 104, ami jól megfelel a Fab’ fragmentum körülbelül 46 000 és az A fragmentum körülbelül 24 000 molekulasúlya öszszegének. Ez igazolja, hogy a 2, csúcsnak megfelelő protein a találmány szerinti protein hibrid, amely egy diszulfid-kötéssel összekötött Fab’ és A fragmentumból épül fel. (d) A tumorellenes protein hibrid citotoxicitásának mérése 1. lépés A korábban említett 2. csúcsnak megfelelő 37. és 38. frakciók elegyítésével vizes oldatot készítettünk úgy, hogy az a protein hibridet 0,84 mg/ml koncentrációban tartalmazza. Az oldat arra szolgált, hogy segítségével meghatározzuk a találmány szerinti protein hibrid citotoxicitását L 1210 egér leukémia sejtekkel szemben. Ötször 104 L 1210 sejtet RPMf 1640 táptalajban (10% magzati borjú szérumot, 20 /rmól 2-merkapto-etanolt és 100 /4g/ml kanamicin-szulfátot tartalmaz) szuszpendálva folyékony kultúrát állítottunk elő. Ugyanezt a folyékony kultúrát öt elkülönített edényben elkészítettük, és az elegyet 37 °C-on 5% COj-ot tartalmazó levegőn 42 órán át inkubáltuk úgy, hogy az egyik adaghoz semmit sem adtunk, a másik adaghoz diftéria toxint adtunk, míg a fennmaradó három adaghoz a találmány szerinti, a (c) lépés szerint elő5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 állított protein hibridet adtuk. A tenyésztés befejeztével az egyes adagokban levő sejteket Trypan Blue festéssel megszíneztük. Miután így megfestettük a halott sejteket, mikroszkóppal megtudtuk számolni az élő sejtek számát. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze : az élő L 1210 sejtek száma 42 órás inkubálás után (%) nem kezelt diftéria toxin 40 Kg/ml tumorellenes protein hibrid 0,5 ^g/ml tumorellenes protein hibrid 5 /tg/ml tuniorellenes protein hibrid 50 pg/ml 8 x 105 (100) 5 x 105 (63) 0,5 x 10s (6,3) 0,03 x 10s (0,4) <0,01 x 10s (<0,1) Az 1. táblázatból világosan látható, hogy a kezdeti 5 x 104 sejtszám jelentősen nőtt (8-szor 10s -re), ha a folyékony kultúrához semmit nem adtunk, ugyanígy jelentős volt a növekedés (5-ször 10s-re), ha diftéria toxint adagoltunk, míg a sejtek száma lényegesen csökkent, ha a találmány szerinti protein hibridet adtuk a kultúrához (1000-nél kisebb sejtszám mérése nem lehetséges). Ismert, hogy az egérsejtek nem érzékenyek diftéria toxinra. 2. lépés A minták citotoxicitásának mérésére ugyanazt a módszert alkalmaztuk, mint az 1. lépésben 2 x 104 L 1210 egér leukémia sejtet tenyésztettünk 48 órán keresztül RPMI 1640 táptalajon, amely 10% magzati borjúk szérumát, 20 mmól 2-merkapto-etanolt és 100 fig/ml koncentrációban kanamicin-szulfátot tartalmazott. A tenyészethez különböző, a 2. táblázatban megadott mintákat adtunk. Az összehasonlítás kedvéért olyan rendszerben is tenyésztettünk L 1210 sejteket, amelyhez nem adtunk további anyagot (kezeletlen), majd 42 óra elteltével meghatároztuk az élő sejtek számát. A kapott eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze: koncentrá- Az élő L 1210 sejtek ció /Jg/ml száma 42 órás inkubálás után (%) kezeletlen — diftéria toxin 40,000 Fab’ 34,000 A fragmentum 18,000 Fab’ + A fragmentum 51,000 mólarány 1:1 5,600 tumorellenes protein hibrid protein 51,000 hibrid protein 5,100 hibrid protein 0,560 hibrid protein 0,056 3,07 x 10s (100) 1,71 x 10s (56) 1,07 x 105 (35) 1,50 x 105 (49) 1,43 x 105 (47) 2,00 x 105 (65) <0,01 x 10s (<0,3) <0,01 x 105 (<0,3) 0,17 x 10* (5,5) 1,60 x 105 (52) Azokban az esetekben, amelyekben a találmány szerinti tumor-ellenes protein hibridet adtuk a tenyészethez, mégha csak 0,56 /Ug/ml koncentrációban is, az élő sejtek száma lényegesen lecsökkent, a fenti 7
