184736. lajstromszámú szabadalom • Eljárás dagantellenes hatású immunglobulin-származékok előállítására
1 2 A fenti módszer szerint a reakció igen mérsékelt körülmények között simán lezajlik, és igen nagytisztaságú hibridet kapunk. A módszer lehetővé teszi a Fab és A fragmentumokból felépülő hibrid szelektív kialakítását, szemben a Fab fragmentumok egymáshoz kapcsolódásából, illetve az A fragmentumok egymáshoz kapcsolódásából kialakult hibridekkel, amelyeket diszulfid kötések kapcsolnak össze. (2) Egy másik módszer szerint egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó Fab fragmentumot egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó A fragmentummal kapcsolunk össze, bármely korábban ismertetett (III) vagy (IV) általános képletű térhálósító reagens segítségével. A reagáltatást úgy végezhetjük, hogy három Fab fragmentumot, a térhálósító szert és az A fragmentumot egyidejűleg érintkezésbe hozzuk egymással, előnyösen azonban úgy állítjuk elő a protein- hibridet, hogy az A fragmentumot a Fab-fragmentum és a térhálósító reagens megelőző reakciójának termékével reagáltatjuk. Úgy is eljárhatunk, hogy a Fab fragmentumot az A fragmentum és a tárhálósító szert reakciójának termékével reagáltatjuk. Az első esetben előnyösen 0,8-6 mól térhálósító reagenst, illetve A fragmentumot használunk 1 mól Fab fragmentumra. Az utóbbi esetben előnyösen 0,8-3 mól térhálósító szert és 0,2-3 mól Fab fragmentumot használunk 1 mól A fragmentumra. A reagáltatást 0 és 60 °C hőmérsékletei. kezdjük. A térhálósító reagenst keverés közben, kis mennyiségű oldószerben, például N,N-dimetil-formamidban, dimetil-szulfoxidban, 1,2-dimetoxi-etánban, metanolban, etanolban, acetonban feloldva adagoljuk a Fab fragmentum oldatához. A pufferelés 6-10-re történik. A protein koncentráció előnyösen 0,5-100 mg/ml, vagy még előnyösebben 1-20 mg/ml. A térhálósítószer feleslege például dialízissel, oszlop kromatográfiában vagy molekulaszitával távolítható el. Ezután egy másik fragmentum oldatot 6-10-re pufferelünk (a protein koncentráció előnyösen a fent megadott), és ennek segítségével 0-60 °C-on folytatjuk a reagáltatást. A kapott protein hibrid elkülönítése a reagkcióelegyből és tisztítása szokásos módszerekkel, például oszlop kromatográfiásan vagy molekulaszitával történhet. (3) további lehetőség, hogy egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó tumorellenes immunoglobulin Fab fragmentumát és egy legalább egy tiol-gyököt tartalmazó diftéria toxin A fragmentumát együttesen oxidáljuk úgy, hogy diszulfid kötéssel kössük össze őket. Az oxidálást végezhetjük a levegő oxigénjével vagy o-jód-benzoesavval vagy o-fenantrolinnal és rézf'/ulláttal, (4) úgy is eljárhatunk, hogy akár Fab, akár az A fragmentumot először az 5,5 -ditio-bisz(2-nitro-benzocsavval) (Ellman reagens), 2,2 -dipiridil-diszulfiddal. 4,4-dipiridil-diszulfiddal vagy tetrationáttal reagáltatjuk, és a kapott reakcióterméket reagáltatjuk a másik (A vagy Fab) fragmentummal. Különösen előnyösek az (1) és (2) eljárások. A találmány szerint előállított tumorellenes protein hibrid egyik molekularésze lényegében az A fragmentumnak felel meg. amely toxikus a daganatsejtekkel szemben míg másik molekularésze lényegében Fab fragmentummal azonos, amely specifikusan felismeri a daganatsejteket éí Olyan speciális hordozóként működik, amely az A fragmentumot a daganatsejtekben irányítja és lehetővé teszi az A fragmentum behatolását a sejtekbe. E tulajdonságok összessége folytán a találmány szerint előállított protein hibrid kiváló jellemzőkkel rendelkezik. Ezek a következők: 1) Miután a találmány szerinti hibrid nem tartalmazza az immunoglobulin Fc részét, elkerülhető az Fc részen keresztül történő kötődés sejtmembránban található Fc receptorokhoz és ennek következtében lehetővé válik az ellenanyaghatás szelektív érvényesítése. 2) Ismert, hogy ha egy xenogén immunoglobulint használunk, az Fc rész mutatja a legerősebb antigén hatást. A találmány szerinti hibrid esetében, miután nem tartalmaz Fc részt, a xenogén immunoglobulin antigén hatása jelentősen csökken. 3) Ismert, hogy a diftéria toxinnak a B fragmentuma képes a sejtek (normál és daganatsejtek) receptoraihoz kapcsolódni, és az A fragmentum, a B fragmentum kapcsolódása révén juthat el a sejthártyába, és csak így fejheti ki citotoxicitását. Miután a találmány szerinti protein hibrid nem tartalmazza a B fragmentumot, nem fejt ki citotoxikus hatás az egészséges sejtekre. Ezen kívül, miután nincs jelen a B fragmentum, a diftéria toxinhoz hasonlítva az antigén hatás is csökken. 4) a találmány szerinti hibrid egy lényegében a Fab fragmentumnak megfelelő molekularészt tartalmaz, amelyet egy tumorellenes immunoglobulinból állíthatunk elő, ez a molekularész pedig specifikusan felismeri a daganatsejteket, és ezáltal lehetővé teszi, hogy az A molekularész kizárólag a daganatsejtekre hasson. Az így sepcifikusan ható A fragmentum igen nagyfokú citotoxicitást mutat a daganatsejtekkel szemben. Találmányunk további részleteit a következő példákkal szemléltetjük. A példákban hivatkozott két mérést, nevezetesen az EF-2-re gyakorolt ADP-ribóz-transzferáz aktivitás mérését, illetve a Fab’ fragmentum koncentrációjának meghatározását egyszeri gyök immunodiffúziós módszerrel a következőképpen hajtottuk végre. Az EF-2-re gykorolt ADP-ribóz-transzferáz aktivitás Az EF-2-t patkány máj homogenizátumból különítettük el, és centrifugálással (12000 g, felülúszó frakció 20 perc után), ammónium-szulfát frakcionálással (40%-os telítettségű felülúszó és 60%-os telítettségű csapadék) és DEAE Sephadex oszlopon végzett kromatografálással (10 mmólos TRIS HCl és 50 mmól kálium-klorid elegyével és 2 merkapto-etanol 1 mólos oldatával kiegyenlítve /pH = 7,6/) részlegesen tisztítva használtuk fel. 0,5 mól TRIS HCl, 20 mmól ditio-treitol (képlete: HSCH2(CHOH)jCH2SH) és 2 mmól etilén-diamin•tetraecetsav 0,1 mólos vizes oldatához (pH = 7,6) 80 omol EF-2-t, 45 mmól 14C- izotóppal jelzett NAD'-t (6550 cpm) és 30 fA vizsgálati mintát (amelyet úgy készítettünk, hogy az oszlopkromatografálással kapott frakciók mindegyikét 10—100-szorosra hígítottuk) adtunk, és az elegyet 10 percen át 37 °C- on tartottuk. Közvetlenül a reagáltatás befejezése után 0,5 ml 5%-os triklór-ecetsavat adtunk a reakcióelegyhez jégfürdőn végzett hűtés közben, és a kivált csapadékot/savban oldhatatlan/összegyűjtöttük egy 0,45 /r-os Millipore szűrőn. Az így kapott csapadék (savban oldhatatlan) radioaktivitását folyadék szcin-184.736 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
