184712. lajstromszámú szabadalom • Eljárás jobbra forgató transz-2-helyettesített- 5-fenil-2,3,4,4a,5,9b-hexahidro-1H-pirifo[4,3-b] indolszármazékok előállítására
1 2 J84.712 4.táblázat A XXII szerkezeti képletű vegyieteknek a 21. példában leírt módon, szintetikus úton előállított és tisztított a-, ß-, y- és 8-enantiomerjei mg/kg egységben kifejezett ED50-értékei. 5 A mérések időtartama: 72 óra. 4. táblázat A XXIIiszerkezeti [a]D EDS0 (mg/kg) képletű vegyidet enantiomerje 1 óra 5 óra 24 óra 48 óra 72 óra a +30,1° 0,023 0,014 0,033 kb.l 10 ß-33,T 10 5,7 10 10 10 y + ï.n 0,178 0,045 0,018 kb.l 1 5- 2,7° 10 5,7 10 10 10 25. példa A H-spíroperidolnak a dopamin-receptorokhoz való kötődésének gátlása Kísérleti módszerek és eredmények Kimutatták, hogy összefüggés van a gyógyszereknek a dopamint kötő helyekkel szemben mutatott affinitása és a feltehetően a dopamin-receptorok által befolyásolt magatartási jelenségekre gyakorolt farmakológiai hatásuk között, lásd például Búrt és munkatársai, Molecular Pharmacol., 12, 800-812 /1976/ és az ott mennyiségi mérésére kitűnő módszert dolgoztak ki Leyson és munkatársai [Biochem. pharmacol., 27, 307—316, /1978/j, akik sugárzó izotóppal jelzett ligandumként (megkötött anyagként) 3H-spiroperidolt (spiperont) használtak. Az alkalmazott eljárás a következő: 250-300 g testsúlyű, Sprague-Dawley CD hím patkányok (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fejét levágjuk, és agyukat egy jéghideg üveglapon azonnal felboncoljuk, eltávolítjuk a corpus striatum-ot (súlya körülbelül 100 mg/agy). A szövetet negyvenszeres (1 gramm szövetre 40 ml) 7,7-es pH-jú, jéghideg 50 mmólos TRIS.HCl [trisz-(hidroximetil)-amino-metán-hidroklorid-oldattal] homoggenizáljuk. A homogenizátumot 50.000 g gyorsulással (20.000 fordulat/perc) 10 percig centrifugáljuk, majd az üledéket ugyanilyen mennyiségű friss puffer-oldattal felszuszpendálva újra centrifugáljuk. Az így kapott üledéket óvatosan felszuszpendáljuk kilencvenszeres térfogatú, hideg, frissen (1 hétnél nem régebben) készített, 7,6-os pH-jú 50 mmólos TRIS-puffer-oldatban, amely a TRIS-en kívül a következő további összetevőket tartalmazza: 120 mmól nátrium-klorid (7,014 g/liter), 5 mmól kálium-klorid (0,3728 g/liter), 2 mmól kalcium-klorid (0,222 g/liter), 1 mmól magnézium-klorid (0,204 g/liter), 0,1% aszkorbinsav (1 mg/ml) és 10 pmól pargilin. (100 ml puffer-oldatra 100 pl pargilin-törzsoldatot használunk, a törzsoldat: 15 mg pargilin, 10 ml kétszer desztillált víz). Az aszkorbinsav-oldatot és a pargilin-oldatot [N-metil-N-(2-propinil)-benzilamin] minden nap frissen kell készíteni. A szövet-szuszpenziót a szöveti monoamin-oxidáz enzim inaktiválásának biztosítása céljából 5 percre 37 °C hőmérsékletű vízfürdő- 25 be tesszük, majd a felhasználásig bejegelve tároljuk. Az inkubációs elegy összetétele a következő 0,02 ml inhibitor-oldat, 1,0 ml szövet-homogenizátum és 0,10 ml a sugárzó izotóppal jelzett anyag oldatából (a jelzett anyag 3H-spiroperidol, New England Nuclear, 23,6 Ci/mmól), és a végső inkubációs elegy 30 koncentrációját 0,5 nannmólosra állítjuk be (általában 2,5 -pl törzsoldatot 17 ml kétszer desztillált vízzel hígítunk). 3-3, az inkubációs közeget tartalmazó kémcsövet 10-10 percig 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, majd az egyes csövek tartalmából 0,9 ml-t Whatman GF/B szűrőn, erősen csökkentett nyomást létrehozó szivattyú alkalmazásával leszűrünk. A szűrőket szcintillációs mérőedényekbe helyezzük, hozzáadunk 10 ml folyadék-szcintillátort és a mérőedényeket körülbelül 5 másodpercig erőteljesen forgatjuk. A mintákat éjszakán át állni hagyjuk, majd 1,0 percen át mérjük a radioaktivitásukat. A kötődés mértékét az 1 mg fehérje által megkötött 3 H-spiroperidol fentamólokban (10'15 mól) mért mennyiségével jellemezzük. Hasonlóképpen 3—3 csővel végezzük el a kontroll vizsgálatot (vivőanyag vagy 1-butaclamol (3a-terc-butil-2,3,4,4a,/3,8,9,13bd,- 45 14-oktahidro-1 H-benzo[6,7]ciklohepta[ 1,2,3-de jpirido[2,l-a]-izokinolin-3-on), 10'7 mól, 4,4 mg-ot feloldunk 20 pl ecetsavban majd 2,0 ml kétszer desztillált vízzel hígítva ÍO'4 mólos törzsoldatot készítünk, amelyet hűtőszekrényben tárolunk), a vakpróbát (d-butaclamol, 10'7 mól, a 10'4 mólos törzs- 50 oldat készítéséhez 2 ml-re 4,4 mg-ot használunk, és ugyanúgy járunk el, mint az 1-butaclamol esetében), és az inhibitor-oldat vizsgálatát. A vizsgált vegyieteknek a kötődést 50%-ban gátló koncentrációját (1C5 o ) fél-logaritmikus papíron felvett koncéntrá- 55 ció-gátlás görbékről olvassuk le. A vízben oldhatatlan vegyieteket 50%-os vizes etanolban oldjuk, és 1%-os oldatukat inkubáljuk. A transz-8-fluor-5-(p-fluor-fenil)-2-[4>-hidroxi-4’-(p-fluor-feml>butil ]-2,3,4,4a,5,9b-hexahidro-1 H-pirido[4,3-b]indol-hidroklorid kiönféle izomerjeire 60 nyert eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza: 16
