184468. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált kolinészteráz enzimkészítmény előállítására
1 184 468 2-etil~N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 8,0) készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 58 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kalcium-foszfát pufferben (pH = 7,0) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből a keverés ideje kétszer 6 óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, 0,1 mólos kálium-foszfát oldattal (pH = 8,0), majd hároszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 8,0) mostuk. Háromszor 10 ml kálium-foszfát oldattal, majd négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és liofilizáltuk. A kitermelés 300,3 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 29,4 /»mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 17. példa 252,7 mg Akrilex C—100 xerogélt (10 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos,hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 9,0) szuszpendáltunk. 125,3 mg N-etiI-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 9,0) készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 60 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg kalcium-foszfát pufferten (pH = 7) készült oldatát adtuk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből a keverés ideje kétr 5 szer 6 óra. A gélt ezután háromszor 10 ml hideg, LZ. 0,1 mólos kálium-foszfát pufferrel (pH = 9,0), majd pb; háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH — 9,0) mostuk. Háromszor ’ 10 ml kálium-foszfát pufferrel, majd négyszer 25 10 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk és li.. ofilizáltuk. A kitermelés 361,9 mg immobilizált kof-■ linészteráz. Aktivitás: 6,8 .«mól butiril-tiokolin-jo! tűd hidrolízise/perc'gramm szárazanyag. 15 j Szabadalmi igénypontok 1.Élj árás immobolizált kolinészteráz enzimkészít- 20 mény előállítására akrilpolimerek felhasználásával, azzal jellemezve, hogy 0,1—10 mekv/g, célszerűen 2—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot tartalmazó a krilamid-akrilsav-N,N-metilén-bisz-akrilamid kopolimert vízben oldható 0 C° alatti hőmérsékleten 2. táblázat A reakcióelegy összetételének hatása a ló vérsavó kolinészteráz immobilizálására, pH = 7,0-nél * 2 3 4 A reakcióelegy összetétele 4* A termék aktivitása “ AC(mg)-100 (súlyrész) 2* (mg) EDAPC (súlyrész) (mg) 3* ChE (súlyrész) (egység/gramm szárazanyag) 99,8 1,66 108,6 1,81 60,1 1 80 100,6 2,12 102,5 2,16 47,4 1 120 253,4 5,04 130,8 2,6 50,2 1 252 200 4 200 4 50 1 240 249,8 5 250 5 50 1 240 300 6 300 6 50 1 215 251,7 5,01 381,1 7,59 50,2 1 137 256,1 5,19 518,3 10,5 49,3 1 45,6 ** AC—100, Akrilex C—100 2* EDAPC, N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 3* ChE, ló vérsavó kolinészteráz 4* Egy egység az az enzimmennyiség, amely 1 ."mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízisét katalizálja perce nként, 25 C°-on. 3. táblázat A rekacióelegy pH-jának hatása a ló vérsavó kolinészteráz immobilizálására A reakcióelegy pH-ja *• A termék aktivitása (egység/gramm szárazanyag) 4,6 101,7 5,0 163,2 6,0 252 7,0 107,6 8,0 2,94 1* Egy egység az az enzimmennyiség amely 1 "mól butiril-tiokolin-jodid hidrolíziést katalizálja percenként, 25 C°-on. szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyü- 50 lettel, célszerűen N-etil-N’-(3-dimetilamido-propil)-karbodiimid-hidrokloriddal vagy N-ciklohexil-N’-(/?)N-metil-morfolin(-etil)-karbodiimid-p-toluol-szulfonáttal 0—4 C° hőmérsékleten kezelünk, mimellett a polimer és a karbodiimid-vegyület aránya 55 1—6:1—11, az így aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban egységnyi kolinészterázt viszünk fel — mimellett a polimer, a karbodiimid és az enzim egymáshoz viszonyított aránya 4—5: 2,5—5:1 —, a kapott terméket mossuk, végül kí- 60 vánt esetben szárítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a kolinészterázt 0,1 mólos kálium-foszfát pufferoldatban pH = 7,0) old- 65 va visszük fel az aktivált hordozóra. Ábra nélkül 7
