184368. lajstromszámú szabadalom • Eeljárás D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-szuklfát előállítására
1 184 368 2 IV. táblázat Akut toxicitási adatok egéren Peptid-aldehid LDso mg/kg i. v. bolus i. p. s. c. p. o. D-Phe-Pro-Arg-H • 2CH,COOH D-Phe-Pro-ArgfCOOHI-H“ D-Phe-Pro-Arg-H *HiS04 heparin 9 38 - 960 - - - 1200 456 230 1800 >2000 nincs irodalmi adat “ Oldékonysági nehézségek miatt a toxicitási értékek egyéb adás módok mellett biztonsággal nem adhatók meg. 4 Egy órás intravénás infúzió mellett riyúlon mérve az LDS0 érték 58 mg/kg-nak adódott. Meglepő módon azt találtuk, hogy a D-fenilalanil-L- prolil-L-arginin-aldehid-szulfát nem állítható elő olyan önmagában ismert eljárásokkal, mint például a) a terc-butiloxi-karbonil-csoport acidolízise ecetsavban oldott kénsawal [Beyerman és munkatársai: in Peptides 1970 (szerk.: H. Nesvadba), 138. old., North Holland, Amsterdam, 1973], b) a 880 844 sz. belga szabadalmi leírás szerinti D-Phe- Pro-Arg(COOH)-H karbaminsav-származék közvetlen átalakítása szabad tripeptid-aldehid-szulfáttá kénsavval, c) a szabad tripeptid-aldehid egyéb sóinak, például a 169 870 sz. magyar szabadalmi leírás szerinti D- fenil-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-acetátnakaz átalakítása kénsavas sóvá ioncserélő gyantával vagy kénsavval. A fenti a—c módon nyert termékek a vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok szerint nem voltak egységesek és/vagy vizes oldatban nem rendelkeztek kellő stabilitással. Azt találtuk, hogy a D-fenilalanil-L-prolil-L-argininaldehid-szulfát egyszerűen és kellő tisztaságban előállítható a megfelelő, amino-terminálisán savérzékeny trifenilmetil- vagy terc-alkoxi-karbonil-védőcsoportot tartalmazó származékából, például a terc-butiloxi-karbonil- D- fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfátból vagy a terc-butil-oxi-karbonil- D-fenilalanil-L-prolil-NG- karboxi-L-arginin-aldehidből 1—12 n vizes kénsawal. Továbbá előáll ítható olyan önmagában ismert eljárással, mint a benziloxi-karbonil- D-fenilalanil-L-prolil-NG-benziloxi-karbonil-L-arginin-aldehid [Z-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H] hidrogenolízise ekvivalens mennyiségű kénsav jelenlétében. A fentiek alapján a találmány eljárás vizes oldatban is nagy stabilitással rendelkező új D-fenilalanil-L-prolil-L- arginin-aldehid-szulfát előállítására, amely abban áll, hogy az amino-terminálisán savérzékeny védőcsoportot tartalmazó D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid hemiszulfátjáról vagy NG-karboxi-számrazékáról a védőcsoportot és adott esetben az Nc-karboxi-csoportot 1—12 mólekvívalens mennyiségben alkalmazott 1—12 n vizes kénsawal 20—40 perc alatt40—60 °C-on eltávolítjuk, majd az oldatot semlegesítjük és a keletkezett szabad tripeptidaldehid-szulfátot elkülönítjük. A kiindulási tripeptid-aldehid amino-terminálisán savérzékeny védőcsoportként előnyösen terc-butiloxi-karbonilcsoportot használunk. A találmány szerinti eljárásban kiindulási vegyületként alkalmazható terc-butiloxi-karbonil-D-fenilalanil-L-prolil-NG-karboxi-L-arginin-aldehidet a 177 098 sz. magyar szabadalmi leírásban foglaltak szerint állíthatjuk elő. Kiindulási tripeptid-aldehidként felhasználható a terc-butiloxikarbonil-D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát is, amely új vegyület és célszerűen az alábbi módon állítható elő: guanidino-csoportján benziloxi-karbonilcsoporttal védett L-arginin-laktámot terc-butiloxi-karbonil-D-fenilalanil-L-prolinnal kondenzálunk, a keletkező védett tripeptid-laktámot redukáljuk, a kapott védett tripeptid-aldehid guanidino-csoportján lévő benziloxikarbonil-csoportot egy ekvivalens mennyiségű kénsav jelenlétében hidrogenolizáljuk 30—40% vizet tartalmazó etanolban vagy tetrahidrofuránban. A találmány szerinti eljárás egy előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy a fenti módon kapott aminoterminálisán védett tripeptid-aldehid-hemiszulfátot 8—12 mólekvivalens, célszerűen 10 mólekvivalens menynyiségben alkalmazott 4—6 n, célszerűen 5 n kénsavban feloldjuk, 20—40, célszerűen 30 percen át 40—60 °C-on célszerűen 50 °C-on tartjuk, és ezt követően az oldatot kalcium-karbonáttal semlegesítjük, és szűrjük. A szűrletet célszerűen liofilizáljuk. Az ily módon előállított termék adott esetben 4—6% kalcium-szulfátot tartalmazhat, amely azonban nem befolyásolja a termék biológiai hatását, illetve gyógyászati felhasználását. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. A példákban megadott Rf értékeket szilikagél (Kieselgel G, Reanal, Budapest) rétegkromatográfiával határoztuk meg az alábbi oldószerekben: 1. etilacetát-piridin-ecetsav-víz — 480:20:6:11 2. etilacetát-piridin-ecetsav-víz — 60:20:6:11 3. etilacetát-piridin-ecetsav-víz — 30:20:6:11 1. példa D-Fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-szulfát előállítása 1. lépés: terc-butiloxi-karbonol- D-fenilalanil-L-prolil- NG-benziloxi-karbonil-L-arginin-laktám 8,6 g (22 mmól) terc-butiloxi-karbonil-NG-benziloxikarbonil-L-arginin-laktámot (880 844 sz. belga szabadalmi leírás) 20 ml etilacetátban szuszpendálunk, és 5 °C-on keverés közben hozzáadunk 40 ml 4 mólos etilacetátos sósav-oldatot. A reakcióelegyet jeges vízhűtés közben 30 percig keverjük, majd 100 ml hűtött etilacetáttal hígítjuk, a kivált csapadékot kiszűrjük, etilacetáttal mossuk, és kálium-hidroxid mellett vákuum exszikkátorban szárítjuk. Az így nyert NG-benziloxi-karboniI-L-arginin-laktámklórhidrátot feloldjuk 20 ml dimetilformamidban, és —10 °C-ra történő hűtés után 6,2 ml (44 mmól) trietilamint adunk hozzá. A keletkező szuszpenziót az alábbi vegyes anhidridhez adjuk. 7,25 g (20 mmól) terc-butiloxi-karbonil-D-fenilalanil-L- prolint [U. Ludescher és R. Schwyzer: Helv.Chim.Acta 55, 2052 (1972)] és 2,22 ml (20 mmól) N-metil-morfolint feloldunk 20 ml dimetilformamidban. Az oldatot —15 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 2,64 ml (20 mmól) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
