184324. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fermentlé szubsztrátum-koncentrációjának növelésére szteránvázas vegyületek mikrobiológiai átalakításánál
1 2 ï 84 374 A találmány tárgya eljárás fermentlé szubsztráturnkoncentrácíójának növelésére szteránvázas vegyületek mikrobiológiai átalakításánál. Ismeretes, hogy a mikrobiológiai átalakítások enzimaktivitását az általános tényezők, mini pH, hőfok stb. mellett a szubsztrátum-koncentráció határozza meg a legjelentősebben. Maximális enzimaktivitás teljes szubsztrátum telítésnél érhető el, ehhez viszont a szubsztrátumkoncentráció az enzim-kcncentráció értékének többszöröse keli, hogy legyen. E koncentráció biztosítása különösen a vízben rosszul oldódó szteránvázas vegyületek biotranszformációjáná! okoz sok gondot. Ismert az is, hogy a fermeníié szubsztrátum telítését az adagolási mód a szubsztrátum minél finomabb eloszlatásával, esetleg oldatba vitelével jelentősen befolyásolja. A mikrobiológiai transzformációknál a szubsztrátumot — akár egyszerre, akár részletekben — oldatban vagy szilárd fázisban lehet adagolni. Mindkét módra számos eljárás ismeretes. Az oldószeres adagolási módok közös jellemzője, hogy valamely — általában vízzel elegyedő — szerves oldószerben oldva juttatják az átalakítandó szubsztrátumot a vizes ferment lébe. Legáltalánosabban az anyag acelonos vagy alkoholos oldatát adagolják a fermentléhez [H. L. Herzog és munkatársai: Tetrahedron 18, 581 (1962): P. W. O’Connell és munkatársai: Appi. Microbiol 3, ló (1955)]. Oldószerként használható propilénglikoi [Karow E. 0 , Petsiavas D. N.: Ind. Eng. Chem. 48. 2213 (1956)], dime túszul foxid (3 419 470 sz. Amerikai Egyesült Áilamok-beii szabadalmi leírás), dimetilformamid [Dulaney E. L., Stapley E. ü.: Appi. Microbiol. 7, 276 ( 1959)]. Újabban eredményesen alkalmaztak e célra erős elektrondonor sajátságú oldószereket is. így tetraliiürofuránt. tetrahidrofurfurilalkoholt. diinctilacetamidot, hexametilfoszfortriamidot ( 176 249 sz. magyar szabadalmi leírás). Az oldószeres adagolási módok hátránya, hogy a fér mentié szubsztrátum-koncentrációja ily módón csak egv bizonyos mértékig növelhető, mivel a magasabb szubsztrátum-koncentráció eléréséhez szükséges oldószermenynyiség már gátolja az átalakítást. Az adagolási módok másik változata szerint az átalakítandó anyagot szilárd formában juttatják a fermeníié be. így régóta ismert például a mikronizált por formában történő adagolás [E. A. Weaver és mtsai: Appi. Microbiol 8, 345 (I960)]. Egy további adagolási mód szerint a szubsztrátum. és Tween-80 dioxános oldatának liofiiizálásával előállított port vizes szuszpenzióban adják a fermentlébe [Martin C. K . Wagner F.: European J. Appi. Microbiol. 2, 243(1976)] Egy újabban ismertté vált eljárás szerint a szubsztrátumként használt szterin szerves oldószeres oldatát vízbe öntik, majd az oldószer elpároiogtatásával nyert szuszpenziót adják a fermentlébe (4 124 607 sz Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Utóbbi adagolási módok hátránya, hogy a szubsztrátum sterilezése — ami az aszeptikus fermentációknál elengedhetetlen — igen gyakran a finom eloszlású porok, szuszpenziók csomósodását, összetapadását eredményezi, ami előnytelenül befolyásolja az oldódást. A találmány célja olyan adagolási eljárás biztosítása, amely lehetővé teszi szteránvázas vegyületek mikrobiológiai átalakításánál a szubsztrátum koncentrációjának növelését, egyben, a fermentievek szubsztrátum telítésének gyorsításává! a?, átalakításba!, résztvevő enzimek optimális működését segíti elő. A fermentievek szubszlrátummal való telítése adott hőmérsékleten az anyag jellemző oldékonysága mellett 5 annál gyorsabban meg}- végbe, minél nagyobb felülettel rendelkezik az adagolt szubsztrátum. A fermentációs átalakításoknál alkalmazható hőmérséklet általában szűk határokon belül, +20 °C és +40 °C kozott választható meg, így a hőfokváltoztatással az 10 anyag oldékonyságát csak kismértékben befolyásolhatjuk. Ismert az is, hogy a szteroidok vízoidékonysága igen csekély, általában 0,05 % alatt van. Szerves oldószerrel növelni lehet a szteroid koncentrációját, viszont magas, 5—10 % körüli szerves oldószer-koncentráció jelenlété- 15 ben kivitelezhető mikrobiológia! átalakítás — mely egyben magasabb szubsztrálum-koncentrációt is lehetővé tenne - csak igen ritka esetben, mint pl. a 151 580 sz. magyar szabadalmi leírásban közölt eljárásban alkalmazható. 20 A szubsztrátum felületnövelésének ismert módja a tnikronizálás. A szteránvázas vegyületek mikronizálásának azonban sok esetben határt szab a sterilezést követő, már említett agglomeráción kívül az anyag tiszíátlansága, pl. olajokkal való szennyezettsége, ill. fizikai-kémiai 25 tulajdonsága, pl. elektromos feltölíődése. Utóbbi nehézségek elkerülésére vizsgáltuk a felületnövelés egyéb lehetőségeit. Meglepő módon azt találtuk, hogy ha a szteránvázas vegyületeket 10 7 —10_1 cin átlagos részecskeátmérőjű szilárd hordozókra rögzítve juttat- 30 juk a fermentlébe, melyekről a vegyület vizes közegben fokozatosan deszorbeálódik, a mikrobiológiai átalakítás magas, 0.1-10 % szubsztrátum-koncentráció mellett is zavartalanul végbemegy. E felismerés azért meglepő, mert ezidáig a mikrobio- 35 lógiai átalakítások a nagy 1 jlagos felülettel rendelkező szilárd anyagoknak csupán adszorplív tulajdonságát hasznosították. mégpedig a fermentievek feldolgozásánál. A keletkezel! tennék fermentléből való megkötésével az adszorbátum kiszűrése és a termék ieoldása után kisebb 40 térfogatból könnyebb extrahálhatóságot lehet elérni. Meglepő azért is, mert M. Kienhoiz [Pharm, ind. 32, 677 (1970)] vizsgálatai szerint a baktériumok zeolitokkal, a nagy fajlagos felülettel rendelkező szilárd hordozók legtipikusabb képviselőivel, érintkezésbe kerülve 45 rövid idő alatt elpusztulnak. A technika állása alapján tehát az volt várható, hogy a nagy fajlagos felületű szilárd anyagok a szubsztrátumot megkötik és így nem lesznek alkalmasak mikrobiológiai átalakításoknál a szubsztrátum magas koncentrációban 50 történő adagolására, illetőleg a mikroorganizmus dőlésével gátolják az átalakítást. Ezzel szemben a fenti hordozók alkalmazása esetén — a szubsztrátum koüoidális eloszlása következtében — az egyébként vízben lassan oldódó szteránvázas vegyüle- 55 tek oldódási sebessége jelentős mértékben megnő, és viszonylag rövid idő alatt túltelített vizes oldatok keletkeznek. A túl telítés azonban nem átkristályosodással, hanem az enzimaktivitás következtében keletkező hasznos terméknek a fermentléből való kiválásával szűnik 50 meg. A nagy fajlagos felületű szilárd hordozókon megfelelő körülmények között adhézióval, ill. adszorpcióval rögzített szteránvázas vegyületek. mint pl. szterolok (koleszterin. sztignraszíerin, szitoszterin, ill. származékaik), szívglükozidok. pregnán-, ill. androsztánvázas szteroidok 55 vizes közegben deszorbeálódnak. A deszorpcic sebessége 7
