184229. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunszabályozó hatású polimervegyületek előállítására
1 184 229 2 hatását független laboratóriumban, a rosszindulatú daganat gátlására. Az alábbiak szerint járunk el. Hím svájci egerek oldalába 2 mm átmérőjű eszközzel szolid szarkóma 180-at ültetünk. Az 5A. példa szerinti polimert intraperitoneális injekcióval adagoljuk a táblázatban megadott koncentrációban, 0,5 ml sóoldatban, hat egymást követő napon át. Az adagolást a tumor beültetését követő napon kezdjük. Öt egérből álló csoportoknak testsúlykilogrammra számítva 25, 50 és 100 mg hatóanyagot adunk. A magasabb, a testsúlykilogrammra számítva 200, 400 és 800 mg-os dózisok toxikusnak bizonyultak. Az utolsó intraperitoneális hatóanyag injekciót követő napon leöljük az állatokat, és eltávolítjuk a tumort, majd megmérjük súlyát. A tumorgátlást úgy számítjuk, hogy a kezelt állatok tumorsúlyát elosztjuk a kontroll állatok tumorsúlyával, és az eredményt százalékban fejezzük ki. Az eredményeket a 15. táblázatban adjuk meg, a táblázatból kiderül, hogy a 100% imidtartalmú etilén-maleinsav-anhidrid nem aktív. 23. példa A találmány szerinti egyik előnyös polimerrel közönséges hím Lewis patkányokon vizsgálatokat végzünk annak megállapítására, hogy a hatóanyag hogyan befolyásolja a peritoneális makrofágok számát, és vizsgáljuk a polimer aktivitását a polisztirol latex részecskék fagocitálására, amely hatás jellemző több immunrendszert befolyásoló anyagra, mint például a Bacillus Calmette Guerin készítményre (BCG), a pirán kopolimerre és más hasonló vegyületre. 2-4 hónapos normál hím Lewis patkányokat hatosával négy csoportra osztjuk, és hatóanyagot, illetve a kontroll esetén sóoldatot adagolunk. Az első csoport intraperitoneálisan 1 ml sóoldatot kap. A második csoport a 7. példában ismertetett 6. táblázat A polimerjét kapja intraperitoneálisan, sóoldatban (1 ml), testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségben. A harmadik csoport a 7. példában ismertetett 6. táblázat A szerinti polimert kapja 1 ml sóoldatban, orálisan, testsúlykilogrammra számítva 30 mg-os mennyiségben. Végül a negyedik csoport intraperitoneálisan adagolt 1 ml sóoldatban 0,1 mg BCG-t kap. A fenti adagolást követő L, 3. és 5. napon a fenti négy csoportba tartozó állat közül kettő-kettő állatot leölünk, és megvizsgáljuk a peritoneális űrben lévő sejteket. A sejteket az alábbiak szerint gyűjtjük össze. Intraperitoneálisan 100 ml RPMI 1640 elegyet injektálunk, és a teljes peritoneális folyadék enyhe masszázsa után elvezetjük, a folyadékot és a sejteket minden egyes állat peritoneális üregéből külön-külön 1000 fordulatszámú centrifúgán összegyűjtjük. A sejteket NSE (nem specifikus eszteráz) festékkel festjük, és háromszor mossuk 4 °C hőmérsékletű fenti eleggyel. Végül 10 ml fenti elegyben szuszpendáljuk az egyes állatokból nyert sejteket, és megszámláljuk azokat. A sejtek átlagosan 80-95% makrofágból állnak, attól függően, hogy milyen kezelést kaptak, és hány nap telt el a kezelést követően. A latex részecskék fagocitásának mértékét a peritoneális űrben lévő sejtek által az alábbiak szerint határozzuk meg. A fentiek szerint előállított sejtszuszpenziót úgy hígítjuk, hogy az 1 ml 50%-os boíjúszérum és RPMI oldat elegyében 40—50 millió sejtet tartalmazzon. A szusz22 penziót 5 ml-es csőbe töltjük. Ehhez 100 lambda polisztirol latexet (10% szilárd halmazállapotú anyag, a részecskék átmérője 1 p. Dow Diagnostics, Indianapolis, Indiana), és a keveréket egy órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután elkülönítjük a sejteket, három alkalommal RPMI eleggyel mossuk, végül 0,5 ml sóoldatban szuszpendáljuk. A sejtszuszpenzióból mikroszkópi kenetet készítünk, és megvizsgáljuk a makrofágok által fagocitált latex részecskék számát. Azokat a sejteket pozitívaknak nyilvánítjuk, amelyek 10 vagy több latex részecskét fagocitáltak, ezeknek a pozitív sejteknek a teljes számát a szuszpenzióban lévő összes sejt százalékában fejezzük ki. A fenti kísérletek két kísérletből származó adatait a 16. táblázatban ismertetjük. A 16. táblázatban közölt adatok szerint a találmány szerinti előnyös polimer nem növeli intraperitoneálisan vagy orálisan adagolva a peritoneális makrofágok számát a kontrolihoz képest, továbbá ezeknek a peritoneális makrofágoknak a latex fagocitáló aktivitása nem emelkedik a közönséges makrofág aktivitás fölé. Ezzel szemben más immunrendszert moduláló szerek, mint például a BCG, nagyban növeli a peritoneális makrofágok számát, és ezek a makrofágok megnövekedett latex fagocitáló aktivitással rendelkeznek. Ez a magas aktivitás három nap múlva és ezt követően a normális értékre csökken. A fenti eredményekkel ellentétben, amely eredmények szerint a találmány szerinti polimerek nem aktiválják a makrofág funkcióját, a 20. és 20A. példákban közölt eredmények szerint ezek a polimerek mindazonáltal B-sejt modulátorok az állatokban, és stimulálják a B-sejt antitest választ, intraperitoneálisan vagy orálisan adagolva. Ezenkívül megfigyeltük, hogy ez a hatás még akkor is jelentkezik, ha a csecsemőmirigy nem funkcionál, ami azt jelenti, hogy a találmány szerinti polimerek helyettesítik a csecsemőmirigy funkcióját a B-sejtek aktivitásával, azaz az antitest termelés növelése következik be. A továbbiakban példákkal szemléltetjük, hogy az előző példákban ismertetett különleges vegyületek a találmány szerinti termékek előállításakor más gyakorlatilag ekvivalens anyagokkal helyettesíthetők. így például az előző példákban ismertetett propilént ekvivalens mennyiségű etilénnel helyettesíthetjük, ezzel az olefinnel gyakorlatilag hasonló eredményeket kapunk. Az előző példákban ismertetett eljárás során használt maleinsav-anhidrid például ekvivalens mennyiségű citrakonsav-anhidriddel helyettesíthető, ezzel a polikarbonsav-anhidriddel hasonló eredményeket kapunk. Az 1. példában megadott etilén-maíeinsav-anhidrid polimer oídószer—nem oldószer frakcionálásával még alacsonyabb átlagos molekulasúlyú termék állítható elő. Ezt az alacsonyabb molekulasúlyú polimert ezután az 1. példa szerint polimer ekvivalens mennyiségével helyettesítve hasonló eredményeket érünk el. A találmány szerinti imidek más gyógyszerészeti szempontból elfogadható sóit is előállíthatjuk oly módon, hogy az ammónium-só-származékokat például nátrium- vagy kálium-sóvá alakítjuk. így például a 3. példa 4. táblázatának 4. kísérlete során előállított ammónium-sót fél-amiddá, fél-szabad karboxil-származékká alakíthatjuk oly módon, hogy az ammónium-sót 5%-os vizes oldatban gyengén bázikus kationcserélő oszlopon, például Amberlite IRC-84 gyantából készült oszlopon 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
