184125. lajstromszámú szabadalom • Új genetikai eljárás antibiotikumot termelő micromonospóra törzsek előállítására
I OH i ÍJ kezett rekombinánsokat szelekcióval ki lehessen választani. Erre felhasználhatók a klasszikus mikrobiálís genetikában is már sikerrel alkalmazott antibiotikum rezisztencia, illetve a különböző auxotrófia jelzések. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja szerint úgy járunk el, hogy a sziszomicint termelő Micromonospora inyoensis ATCC 27600 törzs esetében a növekedéséhez kazaminosavat igénylő, de rifampicin rezisztens, illetve a növekedéséhez kazaminosavakat nem igénylő, de rifampicin szenzitiv (0,5 ug/ml rifampicinre már érzékeny) szülőpárt alkalmazunk. A fúzió után olyan utódokat keresünk, melyek növekedésükhöz nem igényelnek kazaminosavat, de rifampicin rezisztensek, azaz minimál táptalajon 10 ug/ml rifampicin jelenlétében telepet képeznek. A regenerálást nem szelektív, a regeneráláshoz optimális körülményeket biztosító táptalajon végezzük. A rekombináns fenotípusú utódok kiválasztására a regenerálódott telepeket lemossuk, és a szuszpenziót szelektív, 10 ug/ml rifampicin-tartalmú minimál agartáptalajra szélesztjük. Az itt kinőtt telepek a fúzió eredményeként kapott rekombináns fenotípusú egyedekből keletkeznek. A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös foganatosítási módja szerint egy olyan új szelektálási módszert alkalmazunk, melyben az egyik szülőt hővel jelöljük oly módon, hogy az az életképességét teljes mértékben elveszítse, de a genetikai állománya még ép maradjon. Ebben az esetben tehát hőinaktívált citoplazmában visszük be az egyik partner teljes genetikai állományát a másik fúziós partnerbe. A módszer előnye, hogy lehetővé teszi a fúzió utáni szelekciót olyan szülők között is, melyek közül csak az egyik jelzett genetikailag. Ezt az elvet a gentamicin-termelő Micromonospora purpurea var. nigrescens törzsnél (MNG 00122) alkalmaztuk, egy sztreptomicin érzékeny-sztreptomicin rezisztens szülőpár esetében. A rekombinánsok szelektálásához a rezisztens szülő protoplasztjait a fúzió végrehajtása előtt óvatos hőkezeléssel (55°C) inaktiváljuk. Mivel a sztreptomicin érzékenység domináns a sztreptomicin rezisztenciával szemben, a rekombinánsok szelektálásával 8-10 napot kell várni (fenotipusos lag kivárása). 8—10 nap után 10 000 ug/ml sztreptomicint rétegzünk a regeneráló lemezekre. A 20—30 nap múlva megjelenő telepek genetikai állománya eltér a szülőpárokétól. A hőkezeléses inaktiválási technikát alkalmazva és kihasználva, hogy a Micromonospora purpurea var. nigrescens törzs két nagyságrenddel rezisztensebb sztreptomicinre mint a Micromonospora inyoensis, protoplaszt-fúzióvai létrehoztuk a két törzs közötti interspecifikus hibridet. Az eljárás lényege, hogy a sztreptomicin-rezisztens Micromonospora purpurea var. nigrescens törzsből készült protoplaszt szuszpenziót hőkezeléssel inaktiváljuk, majd fuzionáltatjuk a sztreptomicin-érzékeny Micromonospora inyoensis törzsből készített protoplaszt szuszpenzióval. 8—10 nap után 1000 ug/ml sztreptomicin koncentrációjú agart rétegzünk a regenerálandó fúzionáltatott protoplasztokra. A 20-30 nap múlva megjelenő telepek interspecifikus hibridek. A fenti elvek egy másfajta genetikai jelzéssel ellátott 5 szülőpár esetében is alkalmaztuk. Az egyik szülő növekedéséhez kazaminosavat igényel, a másik nem. A rekombinánsok szelektálásához a növekedéséhez kazaminosavat igénylő szülő protoplasztjait a fúzió végrehajtása előtt óvatos hőkezeléssel inaktiváljuk. A fuzionált protoplasztokat minimál agarra rétegezzük. A 20-30 nap múlva megjelenő telepek rekombináns tulajdonsággal rendelkeznek. A találmány szerinti eljárás alkalmazásával kapott megváltozott genetikai állományú törzsek antibiotikum-lermelő képességének vizsgálatára célszerűen a bioszintetizált antibiotikumra vonatkozó szakirodalomban ismertetett módszereket alkalmazhatjuk. így pl. a gentamicin komplexet termelő Micromonospora purpurea var. nigrescens (MNG 00122) törzsből nyert rekombinánsok termelőképességének megállapításakor a vizsgált törzset az antibiotikumtermelés szempontjából optimálisnak ta.Iáit fermentációs körülmények között tenyésztjük [Gadó 1. és mtsai, 168 778 lsz. magyar szabadalom (1973)], majd a tenyészet biológiai összaktívitását Staphylococcus epidermidis tesztorganizmust alkalmazva agardiffúziós módszerrel mérjük, és a bíoszintetizált gentamicin komplex összetételét a Code of Federal Register (21. Food and Drugs 1977 ápr. 1. § 444.20 a/b433—435 oldal) előírásai szerint meghatározzuk. A protoplasztfúziós módszert alkalmasnak találtuk arra, hogy segítségével más, aminoglükozid-termelő Micromonospora törzseken is genetikai információátvitelt hajtsunk végre, viszonylag magas gyakorisággal. A vizsgálatokat az alábbi törzsek esetén végeztük még el: Micromonospora olivoasterospora Micromonospora echinospora Micromonospora purpurea (holotipus) A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi példákat adjuk meg: 1. példa A sziszomicint termelő Micromonospora inyoensis ATCC 27600 jelű törzs alábbi két mutánsának 1. kazaminosav-igényes, rifampicin rezisztens Cas‘RifR 2. kazaminosavat nem igénylő, rifampicin érzékeny Cás+RifS mélyhűtve tárolt vegetatív micéliumával steril körülmények között beoltunk egy-egy 500 ml-es Erlenrneyer-lombikban levő 100 ml steril inokulumtáptalajt, melynek összetétele 1 % szójaliszt 1 % burgonyakeményítő 1 % szacharóz 0,4 % kálcium-karbonát csapvízben szuszpendálva. Az inokulumtáptalajba oltott Cas'Rif^ törzs tenyészetét 40 órán át 37 C°-on rázógépen inkubáljuk, majd sterilen átoltjuk 500 ml-es Erlenmeyer-lombikban levő 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
