183675. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az oxitocin tisztítására
183 675 tott, térhálósított dextrán-gyantából — készített oszlopra visszük fel, amelyet előzőleg 5 és 6 közötti, előnyösen 5,4 pH-értékű, 0,05—0,25 mol/1 — előnyösen 0,1 mol/1 — koncentrációjú ammóniumacetát-oldattal egyensúlyba hoztunk, majd az oxitocint ugyanezen oldattal eluáljuk és kívánt esetben az oszlopot ugyanezzel az oldattal történő mosással regeneráljuk. A találmány szerinti eljárásunkkal tisztított oxitocin tisztasága megfelel a korszerű gyógyszerkészítményekkel szemben támasztott legszigorúbb követelményeknek. A tisztítás végén kapott oldatból hígítással közvetlenül injekciós készítmények gyárthatók. Szükség esetén az oldatból bepárlással és Iiofilizálással korlátlan ideig tárolható, stabilis por készíthető. Ha az oldathoz az oxitocin mennyiségére számított sztöchiometrikus mennyiségű szerves savat adunk, úgy a bepárlás a liofilizálás után az oxitocin cifrát, maleinát, tartarát vagy egyéb alkalmas szerves só alakjában nyerhető ki. A karboximetil-Sephadex gyantán végzett egyensúlyi ioncserés kromatográfia különleges előnyei azért meglepőek, mivel az igen hasonló szerkezetű karboximetil-cellulózokkal (Whatman 23 és 52) cs az erős kationcserélő SE- és SP-Sephadexekkel — bár ezek is alkalmasak az ioncserés tisztításra — megközelítőleg sem sikerült ilyen jó elválasztást elérni, még sokkal kisebb terhelés esetén sem, és ezen a gradiens elució alkalmazása sem változtatott. A találmány szerinti eljárás alkalmazható bármely ismert módszerrel szintetikusan előállított oxitocin tisztítására. Az ismert oxitocin-szintézisek utolsó lépései rendszerint a nonapeptidlánc felépítése során kapott Z-Cys (Bzl)-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys (Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2 védett nonapeptid védőcsoportjainak lehasításából és az így kapott szabad oxitocein oxidativ gyűrűzárásából állnak; a védőcsoportok lehasítása ismert módon, cseppfolyós ammóniában oldott nátriummal történhet. Amennyiben a találmány szerinti eljárást ezzel az ismert oxitocin-szintézismóddal kapcsolatban alkalmazzuk, akkor előnyös, ha már a védőcsoportok lehasítása után, tehát az oxidativ gyűrűzárás előtt is beiktatunk egy kationcserélő gyantán végzett egyszeri tisztítási műveletet. Kationcserélő gyantaként ebben a tisztítási lépésben előnyösen H+ciklusú CM-Sephadex gyantát alkalmazunk. Ebben az esetben tehát oly módon járunk el, hogy a védett nonapeptid védőcsoportjait előnyösen cseppfolyós ammóniuában oldott nátriummal való redukció útján lehasítjuk, majd az ammónia elpárologtatása után a maradékot ionmentes vízben oldjuk és az oldat kémhatását CM-Sephadex C-25 (H+-ciklusú) gyantával pH 8—9-re állítjuk. A gyanta kiszűrése után az oldatot ionmentes vízzel hígítjuk, majd kémhatását ecetsavval 6,5—6,7 pH-értékre állítjuk be és a szokásos módon hidrogén-peroxid jelenlétében levegőátbuborékoltatással az oxidációt lefolytatjuk (151959 számú magyar szabadalmi leírás). A kapott oxitocinoldatot azután vákuumban betöményítjük, kémhatását pH 5,4-re állítjuk, majd felvisszük egy CM-Sephadex C-25 gyantából készített oszlopra, amelyet előzőleg egyensúlyba hoztunk pH 5,4-es, 0,1 mol/1 koncentrációjú ammónium-acetát-oldattal. Az eluciót ugyanezzel az eluennsel végezzük, az átfolyó oldat elnyelését 280 nm hullámhosszon követjük, és a tiszta frakciókat az elnyelési görbe alapján gyűjtjük össze. Az így kapott tiszta oxitocinoldat felhasználható közvetlenül koncentrált oldatként, hígítható injekciós készítmények gyártásához vagy bepárlás és liofilizálás után por formájában korlátlan ideig tárolható. 5 Az ioncserés tisztítás során az oszlopra felvitt oxitocin biológiai aktivitásban kifejezett összmennyiségének 90%-a nyerhető vissza. A liofilizált oxitocin peptidtartalma 80—90% (a tirozintartalom spektrofotometriás mérése alapján). Nagynyomású folyadék- 10 kromatográfiás vizsgálat szerint a termék legfeljebb 3% egyéb peptid-típusú szennyezést tartalmaz az oxitocin mellett. A termék pepiiden kívül vizet és ammónium-acetátot tartalmaz. A találmány szerinti eljárással tisztított oxitocin a szokásos gyógyszerkészítmények alakjában kerülhet gyógyászati felhasználásra. Az ilyen gyógyszerkészítmények az oxitocint enterális vagy parenterális beadásra alkalmas szerves vagy szervetlen vivőanyag kíséretében tartalmazzák. így a gyógyszerkészítmények 20 lehetnek szilárd Iiofilizátumok, mikoris vivőanyagként a peptiddel nem reagáló vegyületek, például mannit, tejcukor, keményítő jöhetnek számításba, lehetnek továbbá oldatok és szuszpenziók, amelyek különböző semleges tartósító és stabailizáló segédanya- 25 gokat is tartalmaznak. Előnyösek azok a gyógyszerkészítmények, amelyek az oxitocint komplex alakjában tartalmazzák, mivel ez elhúzódó hatást nyújt a készítménynek. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli mód- 30 ját közelebbről az alábbi példa szemlélteti. A példában a peptidszármazék jelölésére használt rövidítések az IUPAC-IUB által ajánlottak [J. Bioi. Chem. 247, 977 1972]. Az aminosavak mind L-antipódok. Egyéb rövidítések: Z = N-benziloxikarbonil, 35 Bzl = S-benzil. A fajlagos optikai forgatóképesség mérése Perkin Elmer 141 számkijelzésű fotoelektromos polariméteren történt. Az oxitocin tirozintartalmának meghatározását 0,1 mol/l-es nátrium-hidroxid-oldatban vé- 40 geztük 294 nm hullámhosszon, Pye-Unicam SP 1800 UV-spektrofotométerrel. A nagynyomású folyadékkromatográfiás méréseket Hewlett-Packard 1081 A típusú, Schöffel 770 változtatható hullámhosszú detektorral, Roadyne 7010 loop-injektorral és KUTESZ 45 185 típusú kétcsatornás írószerkezettel ellátott berendezésben végeztük. Az elválasztáshoz Nucleosil 10 Cu (Chrom pack B. V.) 250 mm hosszú, 4,6 mm belső átmérőjű töltetet használtunk. Az elválasztást A:B = 2:3 eleggyel végeztük (A = metanol:acetonit- 50 ril = 5:1 ; B = pH 2,2-es Mcllvain pufferoldat tízszerezésre hígítva, és nátrium-szulfáttal 0,1 mol/1 koncentrációjúra állítva). 500 /ti oxitocinoldatot fecskendeztünk a rendszerbe, és a mérést 1 ml/perc áramlási sebességgel végeztük, 210 nm-en detektálva az oldat el- 55 nyelését. Értékelésre a külső standard módszert használtuk. Standardként olyan többszörösen tisztított oxitocint használtunk, amelynek biológiai aktivitását előzőleg meghatároztuk. Az alábbi példában a találmány szerinti tisztítási el- 60 járást a 151959 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett oxitocin-szintézissel kapcsolatban ismertetjük, megjegyezzük azonban a példa b) szakaszában leírt tisztítási eljárás bármely más úton előállított nyers oxitocinoldattal ugyanígy lefolytatható. 65 3
