183435. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szarvasmarhák vemhességének korai megállapítására
183 435 A találmány tárgya eljárás szarvasmarhák vemhességének korai megállapítására, illetve az inszeminálást követően nem vemhesült és nem ivarzó állatok kiszűrésére, melynél a szarvasmarhák tejének és/vagy vérszérumának progreszteron-tartalmát radioimmunoassay (RIA) útján meghatározzuk. A szarvasmarhák vemhességének megállapítására jelenleg alkalmazott eljárások az alábbi módon csoportosíthatók: A) Fizikális vizsgálatok: 1. Az allantoishólyag kitapintásával végzett vizsgálat nagy gyakorlatot és óvatosságot igényel, a nem körültekintően végzett vizsgálat a magzat károsodásához vezethet. E módszerrel a 42. nap utáni vemhességet lehet teljes biztonsággal megállapítani. 2. A magzati ütődés érzékelésével a vemhesség megállapítása a 60. nap után lehetséges. A fizikális vizsgálatok hátránya, hogy az inszeminálás és a vemhesség megállapítása között viszonylag hosszú idő telik el, ami a nem vemhesült állatok késői kiszűrése miatt gazdaságtalan. B) Laboratóriumi vizsgálatok: 1. Progeszteron meghatározása extrakciós eljárásokkal kombinálva: J. A. Laing a 34519/71 számú angol szabadalmi leírásban két eljárást ismertetett, amelyek azon a tényen alapulnak, hogy a vemhes állatok tejének progeszteron-tartalma jelentősen nagyobb a nem vemhesült állatok esetében mérhető értéknél. A progeszteron meghatározását a délután fejt teljes tejből végzik. a) Bassett és mtsai módszere szerint (J. Endocr. 45/1969/449)a szarvasmarháktól vett tejet meglúgosítva a progeszteront petroléterrel extrahálják, majd a lipoidokat 70%-os vizes metanololdattal távolítják el. A progeszteron meghatározását a tisztított extraktumból, a „fehérjéhez kötődés” (competitive proteinbinding assay: C. P. B.) elvén alapuló eljárással végzik. b) Abraham és mtsai (J. Clin. Endocr. 32/1971/ 619.) módszere szerint a petroléterrel végzett extrakció után extraktumot szárazra párolva a progeszteron mennyiségét RIA-val határozzák meg. Az extrakciós módszerek hátránya, hogy az extrakció művelete és az ezt követő tisztítások miatt az eljárás hosszadalmas, nem gazdaságos és nagyobb mintaszámmal végzendő sorozatvizsgálathoz (pl. 50—200 vizsgálat/nap) nem alkalmas. 2. Progreszteron meghatározása közvetlen RIA-val: a) A progeszteron RIA-val történő meghatározását egyes kutatók (pl. A. R. Midgley és G. D. Niswender: Acta Endocrin (Copenhagen) 147 (1970) Suppl. 320) oly módon végezték,hogy a vizsgálathoz szükséges antiszérum előállításához alkalmazott antigén kialakításakor a progeszteront funkciós csoportjainak valamelyikét felhasználva kapcsolták a marhaszérum-albuminhoz (MSZA), így pl. a C3 - és C2 o - szénatomon oxim -, a Ci 1-szénatomon hemiszukcinát — MSZA — kötést hoztak létre. Az így előállított antiszérumok specifitása azonban nem volt kielégítő, mert a progeszteronnal hasonló szerkezetű más szteroidokkal jelentős mértékben adtak keresztreakciókat. b) Az újabban általánosan elfogadott megállapítás (pl. J. J. Pratt. Clin. Chem. 24 (1978/ 1869.) szerint a szteroidok funkciós csoportjait változatlanul megőrző szteroid-fehéije-konjugátumok alkalmazása előnyösebb. Ennek megfelelő- 5 en egyes kutatók eljárásokat dolgoztak ki a progeszteron MSZA-hoz való kapcsolására a C6 szénatomon. W. J. Riley és mtsai (J. Steroid Biochem. 3 (3) (1972/957.) Közleményükben a progeszteron — 6 — karboximetil — MSZA 10 előállítását és RIA során antigénként való alkalmazását ismertették. Az említett vegyülettel előállított antiszérum specifitása azonban szintén nem bizonyult megfelelőnek, mert pl. prognenolonnal (68%) és pregnandionnal (52%) is 15 igen számottevő keresztreakciót adott. A nem kielégítő specifitás oka, hogy nemcsak a szteroid-fehérje-kapcsolat helye, hanem a kapcsoló csoport kémiai szerkezete is jelentősen befolyásolja az antiszérum tulajdonságait. 20 c) A progeszteron meghatározása szarvasmarhák tejéből és vérszérumából közvetlenül is lehetséges RIA-val, nagy specifitású antiszérumok alkalmazásával. Ilyen eljárásokat ismertettek, pl. Heap és mtsai (Brit. Vet. J. 132/1976/445) (J. 25 Agric, Sei. Camb. 81/1973/151) és Sheldriek és mtsai (Reproduction and Fertility 51/1978/ 473.). Elsősorban a 1 l-dezoxi-kortizol-21-mono-hemiszukcinát-marhaszérum-albumin, a dezoxi-kortikoszteron-21 -monohemiszukcinát- 30 -humánszérum-albumin és a progeszteron-11 ahemiszukcinát-marhaszérum-albumin antigénekkel előállított antiszérumot alkalmazták. A korábbi esetekhez hasonlóan az említett vegyületekkel előállított antiszérumok specifitása sem 35 volt megfelelő, pl. a progeszteron-11-dezoxikorizol-21-monohemiszukcinát-MSZA antigénnel előállított antiszérum 17 a-hidroxi-progeszteronnal 90%-os, a progeszteron-11-hemiszukcinát — MSZA antigénnel előállított antiszérum 40 11 a-hidroxi-progeszteronnal 83%-os keresztreakciót adott. A progeszteron-tartalom fenti meghatározásának másik hátránya, hogy erre a célra különböző tejmintákat (teljes tej, előfej, zsírtalanított tej) használnak, amelye- 45 két a reggeli vagy délutáni fejésből kapnak. E különböző időben gyűjtött és különböző típusú tejminták progeszteron-tartalma azonban jelentősen eltérő lehet, és ez bizonytalanná teszi a vemhesség eldöntését. A szarvasmarhák vemhességi vizsgálatának célja az 50 ideális évenkénti ellés megközelítése. Olyan eljárást kívántunk kidolgozni, amellyel a szarvasmarhák vemhessége kúrán és biztonságosan megállapítható, és a nem vemhesült és nem ivarzó állatok kiszűrhetők. Lényeges, hog> a vizsgálat gyors és gazdaságosan elvégezhető le- 55 gyen. A találmányi gondolat szerint a fenti céloknak megfelelő vizsgálat radioimmunoassayvel (RIA) végezhető, amelyhez nagyspecifitású antiszérumot létrehozó antigén ;dkalmazása szükséges. 60 A kitűzött célnak megfelelően a találmány szerinti eljárás szarvasmarhák vemhességének korai megállapítására, illetve az inszeminálást követően nem vemhesült és nem ivarzó állatok kiszűrésére, melynél a szarvasmarhák tejének és/vagy vérszérumának progeszteron-tartal- 65 mát - újzélandi nyulakban és kecskékben előállított 2
