183432. lajstromszámú szabadalom • Eljárás kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidek specifikus leoldására szilikát tipusú adszorbensről
1 183 432 2 A találmány tárgya új eljárás kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidek specifikus leoldására szilikát-típusú adszorbensről. Több eljárás ismert már az állati szervkivonatokban levő kallikrein-inhibitor és tripszin-inhibitor hatású polipeptidek kinyerésére és tisztítására, adszorbensen, ioncserélőn, vagy immobilizált enzimen történő megkötés, illetőleg az ezekről való leoldás útján. A 153 247 számú magyar szabadalom szerinti eljárásban a szervkivonatból a hatóanyagot szilikát-típusú adszorbensen 5—7 pH értékű közegből kötik meg, majd az adszorbensről 3 pH érték alá savanyított, vízzel hígított poláris szerves oldószerrel, célszerűen vízzel 30— 90%-osra hígított kis szénatomszámú alkohollal, vagy ketonnal oldják le. Az eljárás hátránya, hogy az adszorbens ugyan közel kvantitatíve megköti a hatóanyag polipeptidet, de emellett igen sok ballasztanyagot is adszorbeál (v. ö.: 307 615 számú osztrák szabadalmi leírás, 3. oldal, 56—58. sor), a leoldószer pedig gyenge hatásfokkal (50—60%) és nem specifikusan oldja le a hatóanyagot, így a tisztulás mértéke sem megfelelő. A 2 509 482 számú NSZK-beli szabadalmi közrebocsátási irat oly eljárást ismertet, amely szerint a tripszininhibitor hatású polipeptideket immobilizált tripszinen kötik meg és erről a pH-érték változtatásával oldják azt le. Az eljárás hátránya, hogy igen nagy mennyiségű immobilizált enzim szükséges a megkötéshez, ami kérdésessé teszi nagyüzemi méretben a megvalósíthatóságot. Másik hátránya, hogy a megkötés és leoldás során az inhibitor-hatású polipeptidből részben hatástalan műtermék keletkezik, amely csökkenti a hozamot és nehezíti a további tisztítási lépéseket. Így ez az eljárás nyers szervkivonatok tisztítására nem alkalmas. A 76 773 számú NDK-beli szabadalmi leírás szerint a szervkivonatból a proteáz-inhibitor hatású polipeptidet aktívszénen kötik meg, és erről 20°C és 60° C között 1 — 20%-os kis szénatomszámú alifás monokarbonsavval vagy ásványi savval oldják le 2—5% fenol jelenlétében. Az eljárás hátránya, hogy a hatóanyag leoldását csak igen nagy térfogatban teszi lehetővé, így töményítést alig ér el, és a hatóanyag további kinyerésére a szervkivonat térfogatának 2—2,5-szeresét kitevő térfogatú aceton szükséges. A 2 120 088 számú NSZK-beli szabadalmi közrebocsátási iratban megadott eljárás szerint a kallikrein-tripszin-inhibitor polipeptidet oldatából polistirol-bázisú amfoter ioncserélőn kötik meg, a hatóanyag leoldását pedig sógradienssel kromatografálva valósítják meg. Az eljárás hátránya, hogy az ioncserélőn való megkötést az oldatban levő szervetlen és szerves ionok nagy mértékben befolyásolják. A leírásban közölt példa szerint nem nyers, hanem már előzetesen tisztított 2000 KTE/mg fehérje aktivitású oldatból (KIÉ: kallikrein-inhibitor egység, TIE: tripszin-inhibitor egység) végzik a megkötést. Másik hátránya, hogy a sógradienssel történő kromatografálás nagyüzemi méretben nehezen valósítható meg. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása volt, amely kiküszöböli az ismert eljárások hátrányait és lehetővé teszi a kallikrein- és tripszin-inhibitor hatású polipeptid jó hozammal és megfelelő tisztaságban való kinyerését állati szervkivonatokból, ipari méretben is könnyen megvalósítható módszerrel. Ezt a célt a találmány értelmében oly módon érjük el, hogy az állati szervkivonatból szilikát-típusú adszorbensen megkötött kallikrein- és tripszin-inhibitor hatású 2 polipeptideket, valamely vizes közegben a víznél nehezebben protonálható Lewis-bázis és víz, illetőleg adott esetben Lewis-bázis, valamely protikus oldószer és víz 1 —3 pH-értékre savanyított elegyével oldjuk le az adszorbensről. Lewis-bázis alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek leadható elektronpárjuk révén proton megkötésére vagy koordinatív kötés létrehozására képesek (vö.: Szántay: Elméleti szerves kémia, Budapest 1975, 161. old.). Víznél nehezebben azok a Lewis-bázisok protonálhatók, amelyek savas vizes közegben nem vesznek fel protont és így megőrzik koordinatív kötés létrehozására való képességüket. (Az olyan Lewis-bázisok, amelyek savas vizes közegben protonálódnak, a találmány szerinti eljárásban nem segítik elő a peptidek az adszorbensről való leoldását.) Víznél nehezebben protonálható Lewisbázisként a találmány szerinti eljárásban előnyösen N- szubsztituált vagy szubsztituálatlan karbonsavamidok, valamint karbonsavnitrilek, szulfoxidok, nyüt láncú vagy gyűrűs éterek vagy tioéterek alkalmazhatók. Protikus oldószerként előnyösen etanolt vagy metanolt alkalmazhatunk. A Lewis-bázis mennyiségi aránya a leoldó vizes oldószerelegyben 5—95%, a kívánt esetben a Lewisbázis egy része helyett alkalmazható protikus szerves oldószeré (az egész oldószerelegy súlyára számítva) 20— 70% lehet; a pH-érték beállítására célszerűen sósavat alkalmazunk. A találmány szerinti eljárás bármely olyan ismert kallikrein- és tripszin-inhibitor kinyerési eljárással kapcsolatban alkalmazható, amelynek során az erre alkalmas állati szervekből, mint marhatüdőből, pankreaszból, parotisból vagy májból ismert módszerekkel készített vizes kivonatból a bázisos jellegű kallikrein- és tripszin-inhibitort valamilyen szilikáttípusú adszorbensen, például bentoniton, montmorilloniton vagy hasonlókon adszorbeálhatják, majd erről az adszorbensről szelektíven kívánják leoldani. Ilyen eljárásokat például a 153 140 számú magyar, a 2 447 050 számú NSZK-beli és az 519 914 számú svájci szabadalmi leírások ismertetnek. A kívánt hatóanyagnak az adszorbensről való szelektív leoldására a találmány értelmében tehát oly 1—3 pH- értékre savanyított vizes oldószerelegyet alkalmazunk, amely víz mellett 5—95% mennyiségben valamely savas közegben protont fel nem vevő Lewis-bázist és kívánt esetben e Lewis-bázis egy része helyett valamely protikus szerves oldószert, előnyösen metanolt, etanolt vagy a cetont tartalmaz. Előnyösen úgy járunk el, hogy a hatóanyagként kinyerni kívánt polipeptidet víz mellett 20—90% Lewis-bázist tartalmazó 1—3 pH-értékre savanyított vizes oldattal oldjuk le a szilikát-típusú adszorbensről. Leoldható a hatóanyagként kinyerni kívánt polipeptid víz mellett legalább 5% Lewis-bázist és 20—70% etanolt vagy metanolt tartalmazó, 1—3 pH-értékre savanyított vizes oldattal is. Lewis-bázisként különösen dimetil-formamid, dimetilszulfoxid, tetrahidrofurán, merkapto-etanol, acetamid, acetonítril, vagy' dioxán alkalmazható előnyösen. A találmány szerinti eljárás előnye elsősorban az, hogy a korábbi eljárásokkal szemben lényegesen jobb hatásfokkal és tisztábban nyerhető a polipeptid-hatóanyag. A 153 247 számú magyar szabadalmi leírásban megadott leoldási eljárással a példák szerint a kivonatban levő polipeptid-hatóanyag 54-60%-a oldható le a szilikát-alapú adszorbensről. Ezzel szemben a jelen eljárás szerint, Lewis-bázisoknak a leoldószerben való alkalmazásával, a hozam 80—95%-ra növelhető és a kapott termék lényege-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
