183346. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új 3,4,5-trihidroxi-piperidin-származékok előállítására
1 183 346 2 szerinti hatóanyagot, például 1600 mg mennyiséget, valamint 1 g dl-metionint és annyi szójabablisztet tartalmaz, hogy a premix összsúlya 3,2 g legyen. A sertéseknél alkalmazásra kerülő, a találmány szerinti hatóanyagot is tartalmazó keverék-takarmány például a következő összetételű: 630 g takarmány-gabonaőrlemény: 200 g kukoricaőrlemény 150 g árpaőrlemény 150 g rozsőrlemény 130 g búzaőrlemény 80 g halliszt 60 g szójaőrlemény 58,8 g tapiókaőrlemény 38 g sörélesztő 50 g vitamin/ásványi anyag keverék (összetétele például azonos a csibetakarmánynál alkalmazottal) 30 g lenpogácsaőrlemény 30 g kukoricasikértakarmány 10 g szójaolaj 10 gf cukomádmelasz 2 g hatóanyag-premix (összetétele például azonos a csibetakarmánynál alkalmazottal) Ezeket az anyagokat alaposan összekeverjük és így 1 kg takarmányt kapunk. A megadott takarmánykeverékeket előnyösen csibék és sertések felnevelésére és hizlalására dolgoztuk ki, azonban azonos vagy hasonló összetételek alkalmazhatók más állatok felnevelésére és hizlalására is. Az inhibitorokat alkalmazhatjuk külön-külön vagy tetszés szerinti keverékeik formájában is. In vitro szachardz-inhibitor vizsgálat Az in vitro szacharáz-inhibitor vizsgálattal valamilyen anyag enzim-gátló hatását határozzuk meg a szolubilizált intesztinális diszacharidáz-komplex inhibitor jelenlétében, illetve jelenléte nélkül (úgynevezett 100 %-érték) mutatott aktivitásának összehasonlítása útján. A gátlási vizsgálat specifikusságát meghatározó anyagként gyakorlatilag glukózmentes szacharózt (glukóz < 100 ppm) alkalmazunk; az enzimaktivitást glukóz-dehidrogenáz és nikotinamid-adenin-dinukleotid, mint kofaktorok segítségével a szabaddá vált glukóz spektrofotometriás meghatározása útján állapítjuk meg. Egy szacharáz-inhibitor-egység (SIE) az a gátló hatás, amely egy meghatározott vizsgálati anyagon egy előre meghatározott szacharolitikus hatást egy egységgel (szacharáz-egység = SE) csökkent. A szacharáz-egység az az enzimaktivitás, amely előre meghatározott körülmények között egy jumól szacharózt hasít le percenként és így egy mól glukóz szabaddá válását (amelyet a vizsgálatban meghatároztunk) és egy mól fruktóz szabaddá válását (amelyet a vizsgálatban nem határoztunk meg) eredményezi. Az intesztinális diszacharidáz-komplexet sertés vékonybél-mucosa-ból triptikus emésztés, —20 °C hőmérsékleten 66 %-os alkohollal való kicsapás, a csapadéknak 7,0 pH-értékű 100 mmól-os foszfát-pufferben való felvétele, majd ugyanebben a pufferben végzett dialízise útján nyerjük. 10 ül próbaoldatot — amelyet úgy készítünk el, hogy a vizsgálati anyag extinkciója legalább 10 %-kal, de legfeljebb 25 %-kal alacsonyabb a 100 %-értéknél - összekeverünk 100 ül, 6,25 pH-értékű 0,1 M maleinát-pufferben készített intesztinális diszacharidáz-komplex-hígítással, majd 10 percig 37 °C hőmérsékleten előinkubáljuk. A diszacharidáz-komplex-hígítás aktivitását 0,1 SE/ml értékre állítjuk be. Ezt követően 100 ül, 6,25 pH-értékű 0,1 M maleinátpufferben készített 0,4 M szacharóz-oldat („SERVA 35579”) adagolásával megindítjuk a szacharolitikus reakciót és 37 °C hőmérsékleten 20 perc inkubációs idő elteltével 250 ml 7,6 pH-értékű 0,5 M trisz-pufferben 1 ml glukóz-dehidrogenáz-reagens (1 üveg liofilizált glukózdehidrogenáz-mutarotáz-keverék („MERCK 14053”)) és 331,7 mg ß-nikotinamid-adenin-dinukleotid (szabad sav, „BOEHRINGER” I tisztasági fok) adagolásával leállítjuk a reakciót. A glukóz meghatározásához az anyagot 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk, majd 340 nm-en vakpróbával szemben (szacharóz nélküli enzim) potenciometriásan végezzük a meghatározást. Az inhibitorok gátló hatásának a számítását megnehezíti, hogy a vizsgálandó rendszer kismértékű változásai, például a meghatározásról meghatározásra kismértékben változó 100 %-érték kismértékű változása már nem elhanyagolható a vizsgálati eredmény szempontjából. Ezt a nehézséget úgy küszöböljük ki, hogy minden meghatározásnál standardot használunk. Ilyen standard a C2sH43 Oi8N képletű szacharáz-inhibitor, amelynek fajlagos gátló hatása 77 700 SIE/g és ha 10-20 ng mennyiségben visszük be a vizsgálatba, akkor a fent meghatározott nag' igrendű gátlást eredményezi. Ha ismerjük a 2>f im-nél mért 100 %-érték és a standarddal gátolt anyag ^xtinkciója közötti különbséget, akkor a 100 %-érték és a próbaoldattal gátolt anyag extinkciójából a bevitt inhibitormennyiség figyelembevételével ismert módon kiszámítható a fajlagos gátlóhatás szacharáz-inhibitor-egység/g (SIE/g) értékben kifejezve. 1. példa N-ß-fenoxi-etil-1 -dezoxinojirimicin [(1) képletű vegyület] előállítása 9,7 g dezoxinojirimicin és 12,4 g poralakú kálium-karbonát 100 ml abszolút dimetil-formamidban készített szuszpenzióját 15,7 g /3-fenoxi-etil-bromiddal keverjük 5 órán át 90—100 °C hőmérsékleten. A reakcióelegyet ezután lehűtjük és leszivatjuk. A szűrletet 60 °C hőmérsékletű fürdő alkalmazásával rotációs rendszerű bepárló berendezésben bepároljuk. A bepárlási maradékot forrón, kis mennyiségű vízben oldjuk, 18 órán keresztül 5 °C hőmérsékleten tartjuk, a kapott kristályokat leszivatjuk és jeges vízzel mossuk. 10,5 g kristályos anyagot kapunk, amelynek olvadáspontja 146 °C. 2. példa N-(5-fenoxi-pentil)-l-dezoxinojirimicin [(2) képletű vegyület] előállítása 4,6 g 1-dezoxinojirimicint 6,2 g poralakú kálium-karbonáttal és 11 g 5-fenoxi-pentil-bromiddal keverünk 5 órán át 100 °C hőmérsékleten. A kapott reakcióelegyet lehűtjük és leszivatjuk. A szűrletet 70 °C hőmérsékleten rotációs rendszerű bepárló berendezésben bepároljuk. A bepárlási maradékot mintegy 300 ml etanolban . 5 5 10 15 I 20 25 30 35 I 40 45 50 55 60 65
