183302. lajstromszámú szabadalom • Eljárás helyettesített benzolnitril-származékok előállítására
2. táblázat folytatása Állatkísérlet , Egyszeri orális adagolás Folyamatos orális adagolás Dózis (mg|kg) x2 Dózis***________x2 1. 600 5,36 0,06% 23,62 2. 600 3,659 0,06% 1,38 3. 600 2,139 0,06% 5,81 4. 600 0,252 0,06% 10,61 5. 600 0,719 0,06% 0,26 6. 600 0,609 0,06% 6,21 7. 600 18,94 0,06% 18,82 8. 600 0,095 0,06% 10,45 9. 0,06% 9,03 10. 0,06% 2,84 11. 600 0,64 12. 600 4,805 0,06% 0,215 21. 0,06% 10,513 A 2. táblázat adatai igazolják a találmány szerint előállított vegyületek vizsgált képviselőinek vírusellenes hatását. A szövetkultúrás kísérleti adatok azt mutatják, hogy valamennyi vegyület aktív a három vizsgált vírus (RV— 1 A, RV—2 és Cox A2 i ) vírus legalább egyikével szemben. Ezenkívül bizonyos találmány szerinti vegyületek az RV—5, RV—8 vagy RV—64 vírusokkal szemben is hatásosak voltak. Néhány vizsgált vegyület hatásos vírusellenes sajátosságokat mutatott (94%-os megbízhatósági szinten, azaz x2 nagyobb, mint 3,84) egérkísérletekben. Különösen érdekes az 1. példa szerinti vegyület, kémiai nevén a 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitril, amely mind az „egyetlen orális dózis”, mind a „folyamatos orális táplálás” vizsgálatban vírusellenes hatást mutatott. Az orálisan adagolható vegyületek, amelyek emellett megőrzik vírusellenes hatásukat, igen előnyösen alkalmazhatók, hiszen könnyen beiktathatok emlősök étrendjébe, amint ezt a „folyamatos orális táplálás” próba is igazolja, vagy különböző, a hatóanyagot és megfelelő segédanyagokat tartalmazó orális készítmények formájában adagolhatok. A 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitril a vírusok széles spektrumával szemben mutat vírusellenes hatást más szövetkultúrákban, a következő vizsgálati módszert alkalmazva: 5 mg 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitrilt feloldunk 0,1 ml dimetil-szulfoxidban, és az oldatot legalább 15 percig 56°C-on inkubáljuk. 0,9 ml 56°C-ra melegített oldatot 49% Eaglest, 49% 199 táptalajt, 2% boíjúembrió szérumot és antibiotikumokat tartalmazó fenntartó táptalajba öntünk, majd a kapott 1 ml oldatot 9 ml 56 °C-ra melegített fenntartó táptalajhoz adjuk. Ezt az oldatot a fenntartó táptalajjal 100, 50, 25, illetve 12,5 üg/ml koncentrációjúra hígítjuk. Három-három WI—38 humán embrionális tüdő sejttenyészet kémcsőbe 1-1 ml a vizsgált vegyületet adott koncentrációban tartalmazó táptalajt adunk, majd 3—300 TCID5o (a szövetkultúra ID5 0 -értékének 3—300-szorosa, azaz 3—300-szorosa annak a dózisnak, amely a vizsgált sejttenyészetek 50%-ának megfertőzéséhez szükséges) dózissal inokuláljuk. Ezzel egy időben vírus titrálást végzünk. A szövettenyészeteket szükség esetén kiegészítjük friss táptalajjal (3-4 nap elteltével), míg be nem fejezzük a vírus titrálást. A sejt tenyészeteket tartalmazó kémcsöveket a citopata hatás meghatározása céljából naponta vizsgáljuk. A kísérlet akkor tekinthető befejezettnek, ha a kontroll vírus titrálási kémcsövekben a sejtfelület több, mint 75%-ban károsodik. Ebben az időpontban összehasonlítjuk a kontroll és a találmány szerinti vírusellenes hatású vegyületeket tartalmazó kémcsöveket. A 75%-os vagy ennél nagyobb eltérést „+” jellel, a 74-50%-os elérést „±” jellel, az 50% vagy kisebb eltérést ” jellel jelöljük. A fenti vizsgálat során a 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitrobenzonitril 25 /ag/ml koncentrációban 20 különböző ,rírus szaporodását gátolta, azaz 20 különböző rhinovírussal szemben vizsgálva „+” jelet kapott. Ezek a vírusok a következők: „Hank’s (untyped)” elnevezésű nem tipizált rhinovírus, és 4, 6, 8, 10, 13, 17, 19, 21,29, 39, 56, 58, 59, 60, 64, 69, 74, 75 és 81 típusú rhinovírusok. Egyéb, a fenti módon végrehajtott, de más táptalajjal végzett kísérletekben a 2-(3,4,-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitril gátló hatást mutatott a Coxsackie B2 és Coxsackie B4 vírusokkal szemben, de (legalábbis a vizsgálat során használt koncentrációban) nem befolyásolta a következő vírusok szaporodását: influenza A, influenza WSN, influenza PR 8, parainfluenzal, parainfluenza NDV (Newcastle-i betegség vírus), adenovirus (típusa nincs meghatározva). Herpes simplex vírus (1 típusú) és feline calici vírusként azonosított vírus. A fenti vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nítro-benzonitril különösen hatásos a Picornavírusok, például a kis ribonukleinsav (rna) vírusok, így például a Coxsackievírusok kezelésében. A kísérletek azt mutatják még, hogy ez a vegyület a Ficornavírusok nagy számú képviselőjével szemben hatásosak. A fentiekben ismertetett standard szövettenyészetes kísérleteket és állatkísérleteket végrehajtva azt találtuk, hogy a 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitril lényegesen jobb vírusellenes hatást mutat, mint az összehasonlítóként használt 5-(3,4-diklór-fenoxi)-2-nitro-benzon'.tril. A szövetkultúrás vizsgálat során az 5-(3,4-diklórfenoxi)-2-nitro-benzonitrilt az RV—1A, RV—2 és A21 vírusokkal szembeni hatást vizsgálva nagyobb koncentrációban kellett alkalmazni ahhoz, hogy a citopata hatás 5 3%-os csökkenését okozza. Ezen felül, az összehasonlí'óként használt vegyület nem volt hatásos RV-1A, RV—2 és CosA2 1 vírusokkal szemben. Ezenkívül az alkalmazott koncentrációban az összehasonlító vegyületben mutatott hatást RV—5, RV—8 és RV—64 vírusokkal szemben sem. Az összehasonlító vegyület nem mutatott vírusellenes hatást a „folyamatos orális táplálás” próbában sem. A 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitril további előnyös tulajdonsága, hogy patkánykísérletben orális akut toxicitása 5 g/kg, míg intraperitoneális adagolás esetén akut toxicitása nagyobb, mint 2 g/kg. Beagle kutyáknál az orális akut toxicitás nagyobb, mint 2 g/kg. A 2-(3,4-diklór-fenoxi)-5-nitro-benzonitril számos előnyös tulajdonsága (például széles spektrumú vírusellenes aktivitás, alacsony toxicitása és vírusellenes hatás orális adagolás esetén is) miatt a találmány előnyös foganatosítási módja e vegyület előállítása. A találmány szerinti vegyületek felhasználása úgy törté tik, hogy egy vírust vagy vírus gazda sejtet egy vagy több találmány szerinti, vírusellenes hatású vegyület meghatározott mennyiségével hozunk érintkezésbe. Bár a találmányt semmiképpen nem kívánjuk korlátozni azzal, hogy egy speciális hatásmechanizmushoz kötjük magunkat, úgy tűnik, hogy a vegyületek inkább úgy hat5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
