183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 kvantitatív meghatározásra pedig felhasználhatjuk a kolorimetriát vagy a spektrofotometriát. Az említett módszerek alkalmasak az agglutinációs vizsgálatban is végső meghatározásra. Ezekben a vizsgálatokban nem is annyira a színezék koncentrációja a lényeges, hanem a színezék szol külső megjelenése (kisebb-nagyobb mértékű agglomeráció, esetleges flokuláció, ezáltal előálló színképbeli változások). A színezék (vagy szimultán meghatározáskor színezékek) meghatározására alkalmas még a fluorometriás eljárás, valamint fémkomplexeket tartalmazó színezékek esetében a normál és/vagy lángmentes atomabszorpciós spektrofotometriás eljárás is. Az alábbiakban a találmányt részletesebben példákkal mutatjuk be. 1. példa Humán magzatburokigonadotropin (HCG) kolorimetriás és/vagy vizuális meghatározása az ismertetett DIA módszer szerint (,,szendvics vizsgálat” ) 1.1 Színezék szol előállítása 140 ml desztillált vízben 7 g PalanilR vörös BF (BASF) színezéket diszpergáltunk. A diszperziót 45 percig kevertük szobahőmérsékleten, majd 30 percig centrifugáltuk (125 g = 1225 N/kg). A szupernatáns folyadékot átvittük egy másik centrifugacsőbe, majd 30 percig centrifugáltuk (7500 g = 73 500 N/kg). A szupernatáns folyadékot eltávolítottuk. és a pelle tét 3X 140 ml desztillált vízzel mostuk. A pelletet 70 ml desztillált vízben újra szuszpendáltuk. majd ezt követően hozzáadtunk annyi üveggyöngyöt (3 és 4 mm-es átmérőjű gyöngyök 1 :2 arányú keveréke), hogy a folyadékszint azonos legyen a gyöngyök által meghatározott szinttel. Ezután a szuszpenziót szobahőmérsékleten 5 napig kezeltük egy asztali görgő pádon. A folyadékot dekantáltuk és 30 percig centrifugáltuk (300 g = 2940 N/kg). A szupernatáns folyadékot ezután átvittük egy másik centrifugacsőbe és ismét 30 percig centrifugáltuk (1000 g = 9800 N/kg). Ennek az utóbbi szupernatáns folyadéknak a 3/4 részét gondosan leszívtuk, majd ezt a koncentrált színezék szolt szobahőmérsékleten tároltuk. A kapott szol 20-szorosára hígított mintájának extinkciója 533 (Amax) nm_en 1 ,57 volt. 1.2. Nyúl anti-HCG immunoglobulin/szinezék szol konjugát előállítása Az 1.1 pontban ismertetett színezék szol 0,8 ml-es mintáját felhígítottuk 4.2 ml desztillált vízzel, majd az oldat pH-ját 0.1 mól/liter töménységű nátrium-hidroxiddal vagy sósavval 7,0-ra állítottuk be. E szol extinkciója 533 nm-en (=Amax) 5,0 volt. Ezt követően hozzáadtunk 0,1 ml nyúl anti-HCG immunoglobulin oldatot*), és a reakcióelegyet egy órán át tartottuk szobahőmérsékleten, miközben 15 percenként felráztuk. Ezután hozzáadtunk 1 ml szarvasmarha szérum albumint (BSA-t) (307.2 g BSA + 0,1 g nátrium-mertiolát + 5 mmól NaCl/1. pH=7.0). A diszperziót egy órán át tartottuk szobahőmérsékleten, miközben 15 percenként felráztuk. Ezután az elegyet 30 percig centrifugáltuk (4000 g = 39 200 N/kg). A szupernatáns folyadékot eltávolítottuk. és a pelletet újra szuszpendáltuk oly módon, hogy térfogata 5 ml legyen. A szuszpendáláshoz használt oldat összetétele a következő volt: 51,2 g BSA+0,1 g nátrium-mertiolát + 5 mmól NaCl/1. A szuszpenzió pH-ját 0,1 mól/1 töménységű nátrium-kloriddal 7,0-ra állítottuk be. *)A nyúl anti-HCG immunoglobulin oldatot a következőképp állítottuk elő: Nyúl anti-HCG szérum immunoglobulin frakcióját az ismert nátrium-szulfátos kicsapatásos módszerrel elkülönítettük A csapadékot feloldottuk és dializáltuk, mely műveletekhez NaCl 5 mmól/1 koncentrációjú vizes oldatát használtuk, és az oldat pH-ját szilárd nátrium-karbonáttal 7,0-ra állítottuk be. A dializált oldatot 1 mg/ml-es végső fehéijekoncentrációra (a fehérjekoncentrációt a Warburg-Kalckar-féle képlettel számítva: fehérjekoncentráció mg/ml = 1,45 X A28om - 0,75 X Aj/o"), illetve 0,65 mg/ml-es fehérjekoncentrációra (az IgG-re Also"1, 1% = 14,5 szerint) hígítottuk fel. 1.3 MicroelisaR lapok bevonása nyúl anti-HCG immunoglobulinnal Foszfátpuffer (FFB) 0,04 mól/1 Na2HP04 és 0,04 mól/1 NaH2P04 oldatot összekevertünk, így egy 7,4-es pH-jú oldatot kaptunk, melyhez a 0,15 mól/l-es koncentráció eléréséig NaCl-ot adtunk. A oldat Nyúl anti-HCG immunoglobulint feloldottunk FFB- ben. A kapott oldat töménysége 30 mg/1. B okin 20 g BSA + 0,1 g nátrium-mertiolát/1 FFB. Az A oldat 0,11 ml-es részletét bepipettáztuk MicroelisaR lapok lyukjaiba. ezután a lapokat 16 órán át inkubáltuk 0—4°Con. Leszívatás után minden lyukba B oldatot adtunk 0,11 ml). Ezt követően a lapokat 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten. Végül a lyukakat leszívtuk. háromszor mostuk desztillált vízzel, majd a lapokat megszár tottuk (előszárított szilikagél fölött, 16 órán át szobahőmérsékleten), alumínium rétegekből álló tasakokba (szilikagéles zacskóval) helyeztük, majd 4°C-on tároltuk 1.4 Standard görbe meghatározása HCG-re foszfátpufferben és kontroll vizeletben Foszfátpuffer (FFB) Megegyezik az 1.3 pont alattival, csak 1 g BSA/l-rel és 1 g nátrium-mertiolát/1-rel. / mosópuffer Foszfátpuffer. II mosópuffer O, 1 mól TRIS [(HOCH2)3CNH2] + 0,1 mól NaCl + 0,5 g TweenR-20 + 0,1 g nátrium-mertiolát/1. Az oldat pH-ja 4 mól/1 HC 1-val 7,4-re beállítva. Etanol P. a., 96 tf%. HCG Humán magzatburoki gonadotropin oldata; 1000 1U (immuno-vizsgálat)/ml FFB. Kontroll vizelet Nem állapotos nő vizelete; HyfloR-en átszűrve, majd fagyasztva; felhasználás előtt redős szűrőn átszűrve. Konjugát Az 1 2 pont alatt ismertetettek szerint előállított 9 ml színezék szol/anti-HCG konjugátot összekevertünk 1 ml koncentrált foszfátpufferrel ( 10-szeresére betöményített FFB). 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
