183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
A találmány tárgya eljárás immunokémiailag reaktív komponensek — például haptén, antigén vagy antitest — kvantitatív és kvalitatív meghatározására vizes vizsgálati közegben. Az eljárás az ilyen immunokémiailag reaktív komponensek közötti specifikus kölcsönhatáson alapul. Számos, a specifikus immunokomplexek kialakításán alapuló eljárás ismeretes az immunokémiailag reaktív anyagok kvalitatív és/vagy kvantitatív meghatározására. Számos analitikai eljárás áll rendelkezésre a végtermékként kialakuló immunokomplexek közvetlen vagy közvetett detektálására. A puszta szemmel való leolvasáson kívül széles körben használatosak különböző fizikai módszerek is, így például a spektrofotometria, a fluorometria, a nefelometria és az elektron-/sötétmezőmikroszkópia. Ezek a módszerek nyomjelzőkkel vagy radioaktív izotóp jelzéssel kombinálhatok. Ilyen esetekben a tényleges immunokomplex helyett a komplex egyik komponensével összekapcsolódott nyomjelzó't detektálják, ily módon lényegesen alacsonyabb kimutathatósági határ érhető el. A kvalitatív immunokémiai eljárásokra példaként megemlíthetjük a klasszikus kícsapatásos reakciót (Heidelberger és Kendall, 1930.) és a hasonlóképp az immuno-kicsapódáson alapuló immunodiffúziót (Ouchterlony, 1948), valamint az 1953-ban Grabar által kifejlesztett immuno-elektroforézist. Az utóbbi két eljárásban az antigén és az antitest agaragar gélben diffúzió útján kerülnek szembe egymással. A bekövetkező kicsapódás — akár volt előzetes színezés, akár nem — szabad szemmel észlelhető. Ezen egyszerű módszerek hátránya abban rejlik, hogy a diffúzió meglehetősen hosszú időt vesz igénybe, valamint a kimutathatósági határ is viszonylag magas. A meghatározás kvantitatív módszerei a Mancini (1965; radiális immuno-diffúzió) és Laurell (1966; rakéta-elektroforézis) által kifejlesztett immuno-kicsapatás elvén alapulnak. Ezen módszerek hátránya szintén a meglehetősen hosszú meghatározási időtartam és/vagy a viszonylag magas kimutathatósági határ. Időközben a nem-nyomjelzős technikával dolgozó eljárások mellett számos nyomjelzős eljárást is kifejlesztettek, melyek közül megemlítjük a véragglutinációs tesztet, melynek során a komponensek egyikét hozzákapcsolják a vörös vértestek felületéhez; az immunofluoreszcenciás eljárást, melynek során a komponensek egyikét valamilyen fluoreszcens vegyülettel (fluoroíorral) nyomjelzik; az 1959 táján Yalow és Berson által kifejlesztett radio-immuno-vizsgálatot, melynek során nyomjelzőként fluorofór helyett valamely radioaktív atomot vagy radioaktív csoportot használnak; és a legújabb enzim-immuno-vizsgálatot, melynek első publikációi 1971-ben jelentek meg két egymástól független helyről, a svéd Engvall és Perlmann, illetve a holland Schuurs és van Weemen kutatóktól. Alapelvében ez utóbbi vizsgálat analóg az ismert radio-ímmuno-vizsgálatokkal, azzal a különbséggel, hogy nyomjelzőként radioaktív izotóp helyett egy enzimet használnak. Az elterjedten alkalmazott radio-immuno-vizsgálatok kétségtelenül igen hasznosak, azonban számos lényeges fogyatékossággal rendelkeznek, például a radioaktív anyagokkal való dolgozás kockázatával, a reagensek és a berendezés magas költségeivel, a radioaktív izotóppal nyomjelzett reagensek gyenge stabilitásával, valamint a kvalifikált kezelőszemélyzet kívánalmával. Az enzim-immuno-vizsgálatok nem rendelkeznek a fentiekben felsorolt hátrányokkal, mindazonáltal kívánatos olyan új vizsgálati eljárások kifejlesztése, amelyek még érzékenyebbek, gyorsabban elvégezhetők, könnyebben automatizálhatok, valamint lehetővé teszik több immuno-komponens egyidejű meghatározását. A találmány tárgya immuno-vizsgálatra vonatkozik, mely vizsgálatra az immunokomplex végső detektálásával kapcsolatban az jellemző, hogy egy vagy több immunokémiailag reaktív komponenst közvetlen vagy közvetett módon összekapcsolunk valamely hidrofób színezék vagy pigment vizes diszperziójának vagy az említett színezéket vagy pigmentet tartalmazó polimer magok vizes diszperziójának szemcséivel, és az immunokémiai reakció folyamán vagy egy bizonyos reakcióidő eltelte után a vizsgálati közegben vagy adott esetben a szabad és a nyomjelzővel összekapcsolt komponens vagy komponensek szétválasztása után kapott frakciók egyikében ismert módszerekkel meghatározzuk a színezék jellegét és/vagy mennyiségét. A meghatározandó, immunokémiailag reaktív komponens(ek)ről kvalitatív vagy kvantitatív jelzést kapunk. A találmány szerinti „diszpergált színezékes immunovizsgálat” (DIA = dispersed dye immunoassay) jelentősen egyszerűbb a radio-immuno-vizsgálatnál (RIA), mivel a végső detektáláshoz elegendő a puszta szemmel való leolvasás és/vagy egy egyszerű koloriméter. Az enzimimmuno-vizsgálattal (EIA, ELISAR, EMITR) összehasonlítva a meghatározás az enzim/szubsztrátum inkubálásárak elhagyhatósága miatt egyszerűbb és gyorsabb. Lehetséges továbbá két vagy több komponens egyszerre történő meghatározása is, mikor is nyomjelzőkként olyan kromofórokat használunk, amelyek spektrofometriás úton tisztán megkülönböztethetők. A színezékek nyomjelzőként való felhasználásának előnyei közül végül megemlítjük, hogy a színezékek reprodukálható módon szintetizálhatok, analitikai/kémiai módszerekkel pontosan jellemezhető, a korlátozott stabilitású radioaktív és enzim nyomjelzőkkel összevetve jó stabilitásuk van (kolloid szemcsék formájában), valamint koncentrációjuk változtatható, míg a kimutathatósági határok sem rosszabbak. Kolorimetriás berendezésekben a diszpergált színezékek szoljai előnyösebbek a fémek (például arany) szoljainál, mivel a színezékek szoljai lényegesen nagyobb moláris abszorbanciával rendelkeznek, mint a fémek szoljai. Például: arany szol (szemcseméret: 50 nm): 3300 1 mól-1 cm“1 ; diszpergált színezékek: 5000—80 000 1 mól-1 cm“1 ; ásd K. Venhataraman, ,,The Analytical Chemistry of Synthetic Dyes”, Wiley and Sons (1977). Ezen túlmenően a színezék nyomjelző végső meghatározásakor a szín intenzifikálható (abszorbancia növelése) oly módon, hogy a színezék Szol szemcséit feloldjuk valamely szerves oldószerben (például etanolban, metanolban vagy izopropanolban). Például: nyomjelző [nm] ^•max(^anGí) ]nm| A.lcTM *max |1 g“1 cm“1 ) E [1 mól'1 cm'1 1 Palan ilR Luminous Yellow G 496 70,77 28 300 Luminous Yellow G 464 110,36 44 100 Palan ilR Luminous Red G 520 48,33 19 300 Luminous Red G 544 88,27 35 300 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
