183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 183 201 2 A 9. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-47 törzs helyett Arthrobacter CA-35-Y-37-12 törzset (FERM-P 5 No. 5530, ATCC No. 31660) használunk fel. 49,33 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye. Az elegyet a 6. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzés- 10 nek vetjük alá. A kromatogramot a 13. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa — hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján — rendre a 7«-hidroxi-3,12-diketo-5|3-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3-kolán- 15 savnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-5|3-kolánsavnak és kólsavnak felel meg. Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiásan vizsgáljuk. Valamennyi frakció csak egy vegyületet tartalmaz. 20 Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 13. ábrán feltüntetett kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 16. táblázatban közöljük. 25 16. példa Az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35 törzs helyett Brevibacterium CA-6 törzset (FERM-P No. 5144, ATCC No. 31661) használunk fel. A kapott szilárd anyagot, amely a fermentációs ter- 35 mékek és a kólsav elegye, az 1. példában ismertetett körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá. A kromatogramot a 14. ábrán mutatjuk be. Az E, A, B és D csúcsnak megfelelő frakciókból el- 40 különítjük a termékeket, és az egyes termékek kémiai szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrumadatok egyértelműen igazolják, hogy a felsorolt frakciók rendre 7a-hidroxi-3,12-diketo-A4-kolénsavat, 7a-hidroxi- 45 3,12-diketo-5j3-kolánsavat, 7a,3a-dihidroxi-12-keto-50- kolánsavat, illetve kólsavat tartalmaznak. Az X és Y csúcsnak megfelelő frakciókban lévő vegyületeket nem azonosítottuk. A 14. ábrán bemutatott kromatogramban az X és Y 50 csúcstól eltérő csúcsok alatti területek aránya (vagyis az E : A : B : D területarány) 12,2 : 22,2 : 44,9 : 20,7. Az 1. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35 törzs helyett Corynebacterium CA-53 törzset (FERM-P No. 5532, ATCC No. 31662) használunk fel. 82 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye. A kapott elegyet nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az elemzést az 1. példában közöltek szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy eluálószerként a 30:70 térfogatarányú víz — metanol elegy (pH = 2,5) helyett 30:70 térfogatarányú, 4,0 pH- értékű víz — metanol elegyet használunk fel. A kromatogramot a 15. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcsa - hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján — rendre a 7»-hidroxi-3,12-diketo-5/3-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsavnak, 7a-hidroxi-3,12-diketo-A4-kolénsavnak és kólsavnak felel meg. Az A, B és C csúcsnak megfelelő frakciókból elkülönítjük a termékeket, és a termékek kémiai szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrum-adatok egyértelműen igazolják, hogy termékként rendre 7a-hidroxi-3,12-diketo-5(3-kolánsavat, 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-50-kolánsavat és 7a-liidroxi-3,l2-diketo-A4-kolénsavat kaptunk. 18. példa 1. összehasonlító példa Háromnyakú gömblombikba 10 g, a fentiek szerint előállított 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsavat mérünk be, és a vegyiilethez lassú ütemben 100 ml etilén-glikolt és 20 ml vízben oldott 10 g kálium-hidroxidot adunk. Ezután az elegyhez 10 ml 85 %-os hidrazin-hidrátot adunk, majd a kapott elegyet 2 órán át 100 °C-on visszafolyatás közben forraljuk. Ezután az elegy hőmérsékletét fokozatosan növelve a forralást4 órán át 185—190°C-on folytatjuk, és eközben kidesztilláljuk a lúdrazin-hidrátot. A reakcióelegyet lehűtjük, vízzel hígítjuk, majd az elegy pH-ját 3-ra állítjuk. A kivált csapadékot leszűrjük, vízzel mossuk és levegőn szárítjuk. 8,5 g 3a,7a-dihidroxi-5/3- kolánsavat (CDCA) kapunk. 2. összehasonlító példa Háromnyakú gömblombikba 3 g, a fentiek szerint előállított 7a-hidroxi-3,12-diketo-50-kolánsav 70 ml piridinnel készített oldatát mérjük be, és az oldathoz 1 mól p-íoluolszulfonil-kloridot adunk. A kapott elegyet 1 16. tábláza? Vegyület Konverzióarány, % Hozam, g 7a-Hidroxi-3,12-diketo-5/3-koíánsav (A csúcs) 7,7 3,80 3a,7a-Dihidroxi-12-keto-5j3-kolánsav (B csúcs) 90,0 44,40 7a,12a-Dihidroxi-3-keto-50-kolánsav (C csúcs) 0,3 0,15 Kólsav (D csúcs) 2,0 0,98 23
