183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 183 201 2 35-M-965-3 törzsön hajtjuk végre. A mutagén kezelés hatására három olyan törzset kapunk, amely szelektíven 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5|3-kolánsavat, illetve e sav sóit termeli. Ezeket a törzseket Arthrobacter CA-35-A589, Arthrobacter CA-35-A849, illetve Arthrobacter CA-35- A-107i törzseknek neveztük el. Az Arthrobacter CA-35-A589 törzs telepeiből két jobb termelőképességű törzset különítettünk el. Ezeket a törzseket Arthrobacter CA-35-A589-29-32, illetve Arthrobacter CA-35-A589-47 törzsnek neveztük el. Az Arthrobacter CA-35-A-1071 törzs telepeiből is elkülönítettünk egy jobb termelőképességű törzset, amit Arthrobacter CA-35-A-1071-15 törzsnek neveztünk. Az „M” eljárást az Arthrobacter CA-35-A849 törzsre alkalmazva egy további jobb termelőképességű törzset kaptunk, amit Arthrobacter CA-35-A-1448 törzsnek neveztünk. Az Arthrobacter CA-35-A-1475 törzset úgy alakítottuk ki, hogy az „M” eljárást az Arthrobacter CA-35-A-1448 törzsön hajtottuk végre. Az Arthrobacter CA-35-A-1766 törzset szintén az „M” eljárással alakítottuk ki; ebben az esetben alaptörzsként az Arthrobacter CA-35-A-1071 törzset alkalmaztuk. Az Arthrobacter CA-35-A-1766-15 törzset a kapott Arthrobacter CA-35- A-1766 törzs telepeiből különítettük el. Az Arthrobacter CA-35-Y-37-12 törzset a következő eljárással alakítjuk ki: Az Arthrobacter CA-35 törzs (FERM-P No. 5145, ATCC No. 31651) „A” táptalajon készített ferde tenyészetéből platinakacsnyi mintát veszünk. A mintával 200 mm hosszú, 21 mm átmérőjű kémcsőbe töltött 10 ml „B” tápközeget oltunk be, és az elegyet rázás közben 20 órán át 30°C-on inkubáljuk. A mikroorganizmussejteket 10 000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással elkülönítjük; a centrifugálást 5 percig 5 °C-on, aszeptikus körülmények között végezzük. A kapott sejteket 10 ml steril vízben szuszpendáljuk, a szuszpenziót 7,5 cm átmérőjű Petri-csészébe töltjük, a Petri-csészét csíramentes dobozban elhelyezett 15 W-os ultraibolya fényforrás (2537 Ä) alá helyezzük (a csésze és a fényforrás távolsága kb. 27 cm), és 10 percig ultraibolya fénnyel besugározzuk. Ilyen körülmények között az Arthrobacter CA-35 törzs sejtjeinek körülbelül 99,9 %-a elpusztul. Besugárzás után a mikroorganizmus-sejteket membránszűrőn elkülönítjük, 0,1 mólos foszfátpuffer-oldattal mossuk, majd a felhasznált mosófolyadékkal azonos foszfátpuffer-oldatban szuszpendáljuk. A kapott szuszpenziót normál vizes nátriumklorid-oldattal hígítjuk, majd a „D"-,,G” tápközegeken tenyésztjük a korábban közöltek szerint. Az alaptörzsnél jobb termelőképességű mutáns törzset kapunk, amely szelektíven 3a,7a-dihidroxi-12-keto-50-kolánsavat, illetve e vegyület sóit termeli. 1. példa Arthrobacter CA-35 törzset (FERM-P No. 5145, ATCC No- 31651) tenyésztünk a következő körülmények között: A tápközeg összetétele : Kólsav 100 g Anunónium-nitrát 2,0 g Kálium-dihidrogén-foszfát 2,0 g Dikálium-hidrogén-foszfát 5,0 g Magnéziumszuífát-heptahidrát 0,2 g Élesztőkivonat 0,1 g Nátriumhidroxid 10 g Desztillált víz q.s. ad 1 liter A komponensek összekeverésével kapott, 1 liter térfogatú tápközeget 100 mJ-es részletekben 10, egyenként 500 ml «tartalmú Sakaguchi-lombikba töltjük szét, majd a lombikokba töltött táptalajt 15 percig 120 C-on autoklávban kezeljük. Az egyes lombikokhoz 10-10 ml oltótenyészetet adunk (az oltótenyészet előállítása során az Arthrobacter CA-35 törzset a fenti összetételű tápközegen, rázás közben 2 napig 30°C-on inkubáljuk). Az egyes lombikokba töltött eiegyeket rázógépen 2 napon át 30 °C-on inkubáljuk. A tenyésztés befejeztével a fermentleveket egyesítjük, és a mikroorganizmus-sejteket centrifugálással eltávolítjuk. A felüiúszót 600 ml 1 n vizes sósavoldattal megsavanyítjuk. A kivált csapadékot elkülönítjük, és a folyadékfázist 1 liter etilacetáttal extraháljuk. Az extraktumból forgó bepárlókészüléken lepároljuk az etilacetátot, és a kapott maradékot egyesítjük az előzőekben elkülönített csapadékkal. 85 g szilárd anyagot kapunk, amely kólsav és kolánsav-származékok keveréke. A kapott elegy kis mintájából 1 %-os metanolos oldatot készítünk. 10 pl metanolos oldatot pBondapak C-J8 oszloppal felszerelt nagysebességű folyadékkromatográfiás berendezésbe (HLC-GPC-244 típusú berendezés; gyártja a Waters cég, Amerikai Egyesült Államok) fecskendezünk. Az oszlopot î ml/perc sebességgel 30:70 térfogatarányú víz - metanol eleggyel (pH = 2,5) eluáljuk, és mérjük az eluátum törésmutatóját. A kapott kromatogramot az 1. ábrán mutatjuk be. Az 1. ábrán feltüntetett A, B, C és D csúcs — a felvett referenciamintákkal összehasonlítva - rendre a következő vegyieteknek felel meg: 7a-hidroxi-3,12-diketo- 50-kolánsav, 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-5(3-kolánsav, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-5|3-kolánsav és kólsav. Az A, B és C csúcsoknak megfelelő frakciókból elkülönítjük a termékeket, és a termékek szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrumok adatai egyértelműen igazolják, hogy termékekként rendre 7a-hidroxi-3,12-diketo-5|3-kolánsavat, 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-5)3- kolánsavat és 7a,l 2a-dihidroxi-3-keto-5(3-kolánsavat kaptunk. A 2., 3. és 4. ábrán az A, B és C csúcsnak megfelelő frakciókból elkülönített vegyietek metilésztereinek infravörös spektrumát mutatjuk be, a hiteles minták (A\ B', illetve C'jelű termékek) spektrumaival összehasonlítva. Az A, B és C csúcsnak megfelelő vegyietek és metilésztereik olvadáspont-értékeit a 2. táblázatban közöljük. Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét az 1. ábrán bemutatott kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 3. táblázatban közöljük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 16
