183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 183 201 2 Megállapítottuk, hogy a Brevibacterium CA-6 törzs mikroszkópos képe (például Gram-festése stb.) és élettani jellemzői alapján a Brevibacterium nemzetségbe sorolható. A Brevibacterium CA-6 törzs azonban több jellemző tekintetében eltér a Brevibacterium nemzetségbe tartozó egyéb törzstípusoktól; így például a Brevibacterium nemzetségbe tartozó egyéb törzseknek ostorokkal borított flagellumai vannak, míg a Brevibacterium CA-6 törzs flagellumai polárosak stb. Megállapítottuk azt is, hogy a Corynebacterium CA- 53 törzs szoros rokonságban van a Corynebacterium equi törzzsel. Miként már közöltük, a találmány értelmében úgy járunk el, hogy szubsztrátumként kólsavat vagy kólsavsót tartalmazó tápközegen az adott tápközegen növekedni képes, a fentieknek megfelelő, az Arthrobacter, Brevibacterium vagy Corynebacterium nemzetségbe tartozó mikroorganizmus-törzset tenyésztünk. A találmány szerinti eljárásban szubsztrátumként szabad kólsavat is felhasználhatunk, azonban a kólsavat alkálifém- vagy alkáliföldfém-sója, például nátrium-kólát, kálium-kólát, kalcium-kólát vagy magnézium-kólát formájában is felhasználhatjuk. Szubsztrátumként előnyösen alkálifém-kólátokat alkalmazunk. Ha szubsztrátumként kólátokat használunk fel, a kólátokból vízzel előre meghatározott koncentrációjú oldatot készítünk. Eljárhatunk úgy is, hogy a kólsawal sót képező, előre meghatározott mennyiségű alkálifém- vagy alkáliföldfémvegyületet oldunk fel vízben, és ehhez az oldathoz adjuk a kólsavat; ekkor előre meghatározott mennyiségű kolátot tartalmazó vizes oldatot kapunk. A táptalaj kólsav-, illetve kólsavsó-tartahna széles határok között változhat; a táptalaj a szubsztrátumot (kólsavban kifejezve) például körülbelül 1—500 g/1 koncentrációban tartalmazhatja. Az (I) általános képletű kolánsav-származékok elérni kívánt hozamát, a tenyésztés körülményeit és a gazdasági hatékonyság (például kezelhetőség, feldolgozhatóság stb.) követelményeit figyelembe véve a kólsavat, illetve a kólsav-sókat előnyösen körülbelül 5-300 g/1, célszerűen körülbelül 10-200 g/1 koncentrációban alkalmazzuk (a megadott értékek kólsavra vonatkoznak). A tenyésztést önmagában ismert módon hajthatjuk végre. Rendszerint rázott vagy szubmerz tenyésztést végzünk, folyékony tápközeg felhasználásával. Tápközegként a felhasznált mikroorganizmus számára asszimilálható tápanyagokat tartalmazó közegeket használhatunk fel. A tápközeg egyedüli szénforrásként is tartalmazhatja a kólsavat vagy a kólsav-sót, a tápközeghez azonban adott esetben további szénforrást, például pentózokat (így arabinózt vagy hasonló vegyületeket), hexózokat (így glükózt, mannózt, fruktózt, galaktózt stb.), diszacharidokat (így maltózt vagy hasonló vegyületeket), keményítő-bomlástermékeket (például dextrir.t vagy hasonló vegyületeket), cukoralkoholokat (például szorbitot vagy Hasonló vegyületeket), polialkoholokat (például glicerint vagy hasonló vegyületeket), a felsorolt szénforrások elegyeit és/vagy egyéb tápanyagokat, például polipeptont, peptont, húskivonatot, malátakivonatot, kukoricalekvárt, élesztőkivonatot, aminosavakat, a felsorolt tápanyagok elegyeit és hasonló anyagokat adhatunk. A további szénforrást és/vagy további tápanyagokat rendszerint körülbelül 0,1—10 g/1 koncentrációban adhatjuk a tápközeghez. Nitrogénforrásként például ammónium-szulfátot, ammónium-kloridot, ammónium-foszfátot, ammónium-nitrátot, nátrium-nitrátot, kálium-nitrátot és a felsorolt vegyüleíek elegyeit használhatjuk fel. A nitrogénforrást rendszerint körülbelül 0,5—5 g/1 koncentrációban adhatjuk a tápközeghez. A táptalajhoz továbbá szervetlen sókat, így dikáliumhidrogénfoszfátot, kálium-dihidrogénfoszfátot, magnézium-szulfátot és hasonló vegyületeket is adhatunk, rendszerint körülbelül 0,1-10 g/1 koncentrációban. A mikroorganizmust rázott vagy szubmerz tenyészetben 25-35 °C-on tenyészthetjük; a tenyésztés például 6 órától 5 napig terjedő időt vehet igénybe. A találmány szerinti eljárás során a szubsztrátumként felhasznált kólsav vagy kólsav-sók (1) általános képletű kolánsav-származékokká alakulnak, ezen kívül — amenynyiben a fermentációhoz Arthrobacter CA-35 törzset használunk fel — csekély mennyiségben 7a,12a-dihidroxi-3-keto-50-kolánsav is képződik. Amennyiben az Arthrobacter CA-35 törzs korábban felsorolt mutánsait használjuk fel, tapasztalataink szerint főtermékként az OH X helyén;^ csoportot tartalmazó (I) általános képletű kolánsav-származék, azaz 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5|3- kolánsav vagy e vegyület sója képződik. Abban az esetben tehát, ha 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5j3-kolánsavat vagy e vegyület sóit kívánjuk előállítani, a fermentációhoz előnyösen az Arthrobacter CA-35 törzs mutánsait, célszerűen az Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-P No. 5522, ATCC No. 31652), Arthrobacter CA-35- A589-47 (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653) vagy Arthrobacter CA-35-A-1766-15 (FERM-P No. 5528, ATCC No. 31658) törzset használjuk fel. Ebből a szempontból különösen előnyösnek bizonyult az Arthrobacter CA-35-A589-29-32 és az Arthrobacter CA-35- A589-47 törzs. Ha a fermentációhoz Brevibacterium CA-6 törzset használunk fel, a kólsav, illetve a kólsav-só (Î) általános képletű kolánsav-származékokká alakul, és ugyanakkor csekély mennyiségben 7a-hidroxi-3,12- diketo-A4-kolénsav vagy e vegyület sója is képződik. Ha a fermentációt Corynebacterium CA-53 törzzsel végezzük, a kólsav, illetve a kólsav-só (I) általános képletű kolánsav-származékokká és 7cr-hidroxi-3,12-diketo- A4-kolénsawá vagy e vegyület sójává alakul át. A fermentáció lezajlása után a felhalmozódott termékeket elkülönítjük a fermentléből, majd a termékeket tisztítjuk. Először az oldhatatlan anyagokat, például mikroorganizmus-sejteket stb. távolítjuk el a fermentléből önmagukban ismert módszerekkel, így szűréssel, centriíugálással vagy hasonló eljárással. Ezután a szűrlethez vagy a felülúszóhoz savat adunk; a sav (például sósav) hatására a termékek kiválnak a folyadékfázisból. Ugyanekkor az át nem alakult kólsav vagy kólsav-só is kiválik szabad kólsav formájában. A kivált csapadékot elkülönítjük, majd a szűrletet vagy a felülúszót közömbös szerves oldószerrel (például etilacetáttal) extraháljuk, és az extraktumot bepároljuk. Ezzel a módszerrel a fermentlében oldva maradt terméket és szubsztrátumot csaknem teljes egészében visszanyerhetjük. A bepárlás során kapott maradékot egyesítjük a savas kezeléskor kapott csapadékkal. Az így kapott szilárd anyagból - amely a mikrobiológiai reakció során képződött termékek és a kólsav elegye - kromatográfiás úton különítjük el az egyes vegyületeket. Az Arthrobacter CA-35 törzs vagy mutánsai felhasználásakor kapott szilárd anyagot például a következőképpen dolgozhatjuk fel: A termékeket és a kólsavat a megfelelő metilészterekké alakítjuk, majd 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
